乙型肝炎病毒易感細(xì)胞系的篩選.pdf

1、乙型肝炎病毒(HepatitisBvirus,HBV)是一種小的雙鏈、嗜肝DNA病毒，具有高度的種屬和組織特異性，只感染人和類人猿。目前應(yīng)用較多的HBV感染細(xì)胞模型有如下三類：①整合HBV全基因組至肝癌細(xì)胞，其可表達(dá)HBV復(fù)制中間產(chǎn)物，并分泌HBV顆粒，應(yīng)用最廣泛的為HepG2.2.15細(xì)胞系；②利用肝癌細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染攜帶HBV全基因組的質(zhì)粒；③利用腺病毒系統(tǒng)導(dǎo)入HBV基因組；④利用桿狀病毒導(dǎo)入HBV基因組。但HBV在上述細(xì)胞模型中的復(fù)制

2、過程均非HBV自然感染過程，不能體現(xiàn)HBV生命周期各方面，特別是病毒特殊的細(xì)胞受體及進(jìn)入細(xì)胞核的機(jī)制。人類或樹鼩肝細(xì)胞培養(yǎng)可直接感染HBV顆粒，但其缺點(diǎn)是來源和制備困難，感染效率也較低，維持時(shí)間短。法國(guó)學(xué)者Gripon等建立的肝癌細(xì)胞系HepaRG，可以被含HBV的血清直接感染，但感染前細(xì)胞需在一定條件下誘導(dǎo)分化，且病毒復(fù)制水平太低，感染能力尚不穩(wěn)定。因此，目前缺乏高效HBV易感細(xì)胞模型。確立一種自然易感乙肝病毒的細(xì)胞系對(duì)乙肝病毒的研究

3、及慢性乙肝的治療非常重要。本研究通過用表達(dá)殺稻瘟菌素（Bsd）抗性的重組HBV顆粒感染多種肝癌細(xì)胞，經(jīng)殺稻瘟菌素多輪篩選，提供了一個(gè)維持HBV自然感染和復(fù)制的細(xì)胞模型。并利用這一細(xì)胞模型，觀察了拉米夫定的抗病毒作用。
　　目的：篩選一個(gè)可維持HBV感染與復(fù)制的細(xì)胞模型
　　方法：取肝癌患者的癌組織，經(jīng)分離培養(yǎng)并連續(xù)傳代后，有15例獲得了較好生長(zhǎng)狀態(tài)的細(xì)胞，連同本實(shí)驗(yàn)室的HepG2、Huh7、QSG-7701、SMMC-772

4、1細(xì)胞系，感染表達(dá)Bsd抗性基因的重組HBV-Bsd顆粒，應(yīng)用Bsd篩選抗性克隆。經(jīng)篩選前后比較，確定一株有前景的細(xì)胞，繼續(xù)進(jìn)行8輪篩選（S1-S8），每輪篩選均留存細(xì)胞備用。將QSG-7701-S0至QSG-7701-S8多代細(xì)胞感染HBV攜帶者血清，通過ELISA、熒光定量PCR檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中HBsAg、HBVDNA含量，并提取細(xì)胞裂解液SouthernBlot檢測(cè)HBVDNA，以證明經(jīng)過多輪篩選后，細(xì)胞對(duì)HBV的感染性增強(qiáng)。

5、為進(jìn)一步研究最終確定的HBV易感細(xì)胞系的特性，感染HBV后，通過SouthernBlot，觀察其對(duì)HBV感染劑量的依賴性；通過感染表達(dá)熒光蛋白的重組HBV-hrGFP顆粒，觀察GFP的表達(dá)；并在感染后不同時(shí)間，經(jīng)SouthernBlot、NorthernBlot和ELISA檢測(cè)病毒復(fù)制中間體、HBVRNA及培養(yǎng)液中HBsAg變化；利用這一細(xì)胞模型，通過Southern觀察拉米夫定的抗病毒作用。
　　結(jié)果：取篩選后獲得的S1(sel

6、ection1)細(xì)胞與相應(yīng)的S0細(xì)胞，感染高滴度HBV攜帶者血清，8天后取細(xì)胞培養(yǎng)上清液，應(yīng)用化學(xué)發(fā)光法定量檢測(cè)HBsAg，發(fā)現(xiàn)QSG-7701細(xì)胞對(duì)HBV的易感性基礎(chǔ)水平最高，后續(xù)試驗(yàn)以此細(xì)胞株繼續(xù)傳代培養(yǎng)，并連續(xù)8輪篩選，分別命名為S1-S8。取S0、S1、S3、S5、S7、S8細(xì)胞，感染高滴度HBV攜帶者血清，用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液，發(fā)現(xiàn)HBsAg有明顯升高趨勢(shì)，S8細(xì)胞上清中HBsAg含量達(dá)15.8ng/ml。應(yīng)用熒光定

7、量PCR檢測(cè)了上清液中HBVDNA，也提示有明顯升高趨勢(shì)。收集細(xì)胞裂解液，提取HBVDNA，經(jīng)SouthernBlot檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)HBV復(fù)制能力逐漸增強(qiáng)。HBV復(fù)制中間體在S8中有相對(duì)較高水平表達(dá)。
　　在QSG-7701-S8細(xì)胞中，分別加入不同劑量的HBV感染者血清，應(yīng)用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中HBsAg，發(fā)現(xiàn)其與感染的病毒量呈明顯劑量依賴性。利用重組HBV顆粒HBV-hrGFP，感染QSG-7701-S0、QSG-770

8、1-S8細(xì)胞系，在熒光顯微鏡下發(fā)現(xiàn)QSG-7701-S8對(duì)HBV的易感性明顯增加。QSG-7701-S8感染HBV感染者血清后不同時(shí)間點(diǎn)，分別收集細(xì)胞裂解液，提取細(xì)胞內(nèi)總DNA，行SouthernBlot檢測(cè)，于感染6天可見少量復(fù)制中間體，9和12天可見HBVDNA量明顯增加，并可見cccDNA形成。提取細(xì)胞內(nèi)總RNA，行NorthernBlot檢測(cè)，證實(shí)在感染后6天起，檢測(cè)到HBVRNA的表達(dá)，并隨時(shí)間不斷增加。應(yīng)用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)，發(fā)

9、現(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中HBsAg自5天開始升高，8-10天達(dá)高峰（16ng/ml），隨后逐步下降。通過SouthernBlot檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)DMSO可強(qiáng)化HBV復(fù)制。行體外抗病毒實(shí)驗(yàn)，并經(jīng)SouthernBlot證實(shí)，拉米夫定可抑制HBV復(fù)制并呈劑量依賴性。
　　結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，QSG-7701細(xì)胞可自然感染HBV，并能維持病毒復(fù)制，經(jīng)Bsd篩選，感染效率及復(fù)制能力明顯提高。本實(shí)驗(yàn)提供了一個(gè)可以自然HBV感染與復(fù)制的細(xì)胞模型，可為H