應(yīng)激性反應(yīng)原作用于MicroRNA與CD44之間表達(dá)平衡進(jìn)而影響胃癌干細(xì)胞的表型形成的初步研究.pdf

1、腫瘤干細(xì)胞假說(shuō)認(rèn)為腫瘤中存在一小部分亞群細(xì)胞，其生長(zhǎng)特性類(lèi)似與正常干細(xì)胞，具有自我更新，維持腫瘤生長(zhǎng)和保持腫瘤異質(zhì)性的能力。雖然該理論遠(yuǎn)未成熟，而且還存有諸多科學(xué)問(wèn)題亟待解決，但經(jīng)過(guò)學(xué)者們不懈努力，越來(lái)越多的證據(jù)和實(shí)驗(yàn)結(jié)果均證實(shí)了腫瘤干細(xì)胞的存在。2009年，Takaishi等從胃癌細(xì)胞系中分離得到了CD44表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞亞群，這些CD44+細(xì)胞具有腫瘤干細(xì)胞自我更新和腫瘤異質(zhì)性的能力，還能夠?qū)?、放療誘導(dǎo)的細(xì)胞程序性凋亡產(chǎn)生抵抗作用。

2、
　　 目的：選擇CD44作為分離標(biāo)記，研究其在胃癌原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移灶組織內(nèi)的表達(dá)，通過(guò)酶消化聯(lián)合化療藥物篩選法分離胃癌干細(xì)胞，并對(duì)原代分離培養(yǎng)的胃癌干細(xì)胞的表型進(jìn)行檢測(cè)。以MicroRNA和CD44之間表達(dá)平衡為突破口，研究應(yīng)激性反應(yīng)原如何作用與這兩者之間平衡影響干細(xì)胞的表型形成，為進(jìn)一步從新的角度揭示胃癌發(fā)生發(fā)展的可能分子機(jī)制，并針對(duì)腫瘤干細(xì)胞為靶點(diǎn)，為開(kāi)辟早期診斷、治療胃癌的新途徑奠定方法和理論基礎(chǔ)。
　　 方法：所有

3、細(xì)胞培養(yǎng)均使用10％胎牛血清，加入配好的抗生素液體中（青/鏈霉素100U/mL、100μg/mL）。細(xì)胞表型檢測(cè)使用流式細(xì)胞儀（BD FAcscalibur）分選，未加熒光標(biāo)記一抗的腫瘤細(xì)胞作為空白對(duì)照。western blot檢測(cè)CD44、Lin28在胃癌原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶的表達(dá)。半定量RT-PCR及實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)miR-373的表達(dá)，雙螢光素酶檢測(cè)分析STAT3和AP-1表達(dá)水平，實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)異丙腎上腺素處理后胃癌細(xì)胞系表面標(biāo)

4、記Rex-1和Nanog表達(dá)，Western blot結(jié)果表明β-腎上腺素受體在胃癌原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移灶表達(dá)。
　　 結(jié)果：雖然胃癌原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移灶內(nèi)均存在著CD44+亞群細(xì)胞，但是相比原發(fā)灶，轉(zhuǎn)移灶內(nèi)CD44+亞群細(xì)胞的比例顯著上調(diào)（約30倍）。Western blot檢測(cè)從蛋白水平上證實(shí)了CD44、Lin28在胃癌原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶組織內(nèi)存在著表達(dá)差異?；熕幬锖Y選培養(yǎng)結(jié)果顯示，CD44+亞群細(xì)胞能夠?qū)W沙利鉑產(chǎn)生抵抗，并且能夠逃避奧沙

5、利鉑誘導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞程序性死亡。篩選培養(yǎng)后CD44+細(xì)胞不但具有強(qiáng)大的分離增殖能力，而且能夠在體外培養(yǎng)形成球體克隆。
　　 miR-373在胃癌原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移灶組織存在表達(dá)差異。miR-373在原發(fā)灶內(nèi)表達(dá)的量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其在轉(zhuǎn)移灶內(nèi)的表達(dá)量。miR-373可能通過(guò)正向調(diào)控E-cadherin影響EMT，從而影響腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。miR-373能夠在體內(nèi)和體外抑制CD44的表達(dá)，影響胃癌干細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化。miR-373的啟動(dòng)子區(qū)域含有

6、STAT3和AP-1結(jié)合位點(diǎn)，其上游信號(hào)通路活化后，通過(guò)激活STAT3信號(hào)通路和JNK/SAPK信號(hào)通路，抑制miR-373的功能，間接地促進(jìn)CD44的表達(dá)，使細(xì)胞表型向胃癌干細(xì)胞的方向發(fā)生偏移。應(yīng)激性反應(yīng)原與其受體結(jié)合后，激活β腎上腺素受體-cAMP-PKA信號(hào)通路，從而上調(diào)STAT3和c-Jun的表達(dá)水平，影響miR-373的剪切及成熟，間接地抑制CD44的表達(dá)及胃癌干細(xì)胞的表型形成。
　　 結(jié)論：轉(zhuǎn)移灶內(nèi)CD44+亞群細(xì)胞