HSP70-2基因在鼻咽癌細胞增殖與凋亡中的作用.pdf

1、目的:
　　本研究通過慢病毒技術上調(diào)鼻咽癌細胞6-10B的HSP70-2基因的表達和異黃酮類藥物ZSGS-4下調(diào)鼻咽癌細胞6-10B和5-8F的HSP70-2基因的表達,探索HSP70-2基因?qū)Ρ茄拾┘毎鲋车挠绊憽?br>　　方法:
　　一方面應用慢病毒技術,構建pLV-HSP70-2-IRES/eGFP-Neo目的慢病毒載體和pLV-CMV-eGFP-Neo空載慢病毒載體,分別獲得目的慢病毒和空載慢病毒轉(zhuǎn)導的6-10B細

2、胞穩(wěn)轉(zhuǎn)株,即6-10B-HSP70-2/eGFP細胞(目的基因組)和6-10B-blank/eGFP細胞(空載對照組),上調(diào)6-10B細胞HSP70-2基因表達。另一方面應用黃酮類藥物ZSGS-4下調(diào)鼻咽癌細胞6-10B和5-8F的HSP70-2基因表達。繼而應用Western blotting檢測hsp70-2蛋白表達水平;CCK8檢測細胞生長曲線;流式細胞儀檢測細胞周期和凋亡狀況。
　　結果:
　　首先構建了pEntry

3、221-HSP70-2-IRES/eGFP入門載體,再應用 LR反應構建了pLV-HSP70-2-IRES/eGFP-Neo目的慢病毒載體和pLV-CMV-eGFP-Neo空載慢病毒載體,再運用慢病毒4質(zhì)粒包裝系統(tǒng)成功包裝出目的慢病毒和空載慢病毒,分別轉(zhuǎn)導6-10B細胞后經(jīng)G418篩選出各自的單克隆細胞,利用Western blotting方法檢測各組細胞hsp70-2蛋白表達水平,即6-10B-HSP70-2/eGFP細胞組與6-10

4、B-blank/eGFP細胞組或與6-10B細胞組比較,hsp70-2蛋白表達量升高75.31±3.54％(P<0.01)或75.13±3.36%(P<0.01),驗證了6-10B-HSP70-2/eGFP和6-10B-blank/eGFP細胞穩(wěn)轉(zhuǎn)株。6-10B-HSP70-2/eGFP細胞、6-10B-blank/eGFP細胞和6-10B細胞分別培養(yǎng)24h、48h和72h后,6-10B-HSP70-2/eGFP細胞與6-10B-bla

5、nk/eGFP細胞比較,細胞增殖率分別升高29.18±0.014%(P<0.01)、81.72±0.124%(P<0.001)和41.84±0.004%(P<0.001);與6-10B細胞比較,細胞增殖率分別升高25.69±0.031%(P<0.01)、84.53±0.060%(P<0.001)和45.28±0.044%(P<0.001)。6-10B-HSP70-2/eGFP細胞、6-10B-blank/eGFP細胞和6-10B細胞分別

6、培養(yǎng)24h后,6-10B-HSP70-2/eGFP細胞與6-10B-blank/eGFP細胞比較,增殖指數(shù)(PI)和S期細胞比率(SPF)分別增加73.31±5.882%(P<0.001)和71.09±7.495%(P<0.01);與6-10B細胞比較,PI和SPF分別增加72.60±1.300%(P<0.001)和69.29±13.42%(P<0.01)。細胞凋亡百分比,各組間相比無明顯變化(P>0.05)。
　　另一方面,應用

7、不同濃度的異黃酮類藥物ZSGS-4(0μg/mL、10μg/mL、12.5μg/mL、15μg/mL和17.5μg/mL)分別處理6-10B和5-8F細胞12h。各實驗組與對照組比較,hsp70-2蛋白的表達水平明顯降低(p<0.05);細胞抑制率明顯增強(p<0.05);G0/G1期和S期DNA含量明顯降低(p<0.05);subG0/G1期和G2/M期DNA含量明顯升高(p<0.05);細胞凋亡率明顯升高(p<0.05)。