骨橋蛋白對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖作用和機(jī)制及二者在乳腺癌中相關(guān)性的研究.pdf

1、傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為，成體中血管再生和改建僅由鄰近血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和爬行這種“血管新生(angiogenisis)”方式來(lái)實(shí)現(xiàn)。1997年，Asahara等首次在Science上提出內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cell，EPC)并證實(shí)EPC具有在體內(nèi)外增殖、遷徙、分化為成熟內(nèi)皮細(xì)胞形成血管的能力。隨后大量研究證實(shí)，成體新生血管除了血管新生方式外，還可以由干細(xì)胞分化成能定向分化為內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞EPC，再分化為成熟

2、血管內(nèi)皮細(xì)胞，形成血管的“血管生成(vasculogenesis)”方式來(lái)實(shí)現(xiàn)。腫瘤生長(zhǎng)、侵襲、轉(zhuǎn)移均為血管生成依賴(lài)性的。研究表明，EPC的增生與分化是腫瘤血管形成的關(guān)鍵步驟，EPC是內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，在腫瘤新生血管形成中占有重要地位。當(dāng)前，EPC的分離、培養(yǎng)、鑒定，體內(nèi)分布、來(lái)源、分化、遷徙、歸巢、功能及應(yīng)用等方面正被廣泛而深入的研究。本研究第一部分，對(duì)從人骨髓分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增出的EPC及細(xì)胞鑒定進(jìn)行探討。
　　 某些類(lèi)型腫

3、瘤中，腫瘤負(fù)荷，組織學(xué)分級(jí)，病理分期，預(yù)后與外周血循環(huán)EPC數(shù)量明顯相關(guān)。腫瘤分泌VEGF，SDF-1，G-CSF，GM-CSF等多種細(xì)胞因子和趨化因子調(diào)控EPC的動(dòng)員、增生、遷移、分化及歸巢功能。骨橋蛋白(osteopontin，OPN)稱(chēng)為“惡性轉(zhuǎn)化相關(guān)因子”。腫瘤組織和血漿血清中高表達(dá)OPN的乳腺癌患者容易發(fā)生轉(zhuǎn)移，預(yù)后不良。研究發(fā)現(xiàn)OPN作為成血管因子，與腫瘤血管形成相關(guān)。OPN在腫瘤中的高表達(dá)與腫瘤血管密度(MVD)相關(guān)，Ta

4、kahashi F等研究發(fā)現(xiàn)OPN在體外可以促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖，提示了OPN有可能通過(guò)血管形成的參與者內(nèi)皮細(xì)胞來(lái)提高腫瘤血管形成，從而有利于腫瘤生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移。但是OPN對(duì)于EPC的增殖作用及其機(jī)制未見(jiàn)報(bào)道。OPN是否能夠促進(jìn)腫瘤血管形成的重要參與者內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞EPC增殖，從而在祖細(xì)胞水平，也即有很強(qiáng)的集落形成能力的細(xì)胞階段使其數(shù)量大為擴(kuò)增，而形成用以滿足腫瘤生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移所必需的大量營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的新生血管的作用及機(jī)制需要深入研究。

5、r>　　 目的：探討從人骨髓中分離、培養(yǎng)EPC的方法。觀察OPN對(duì)EPC的增殖作用并初步探索其作用機(jī)制，以及檢測(cè)乳癌OPN表達(dá)與循環(huán)EPC數(shù)量的相關(guān)性。
　　 方法：
　　 1、人骨髓來(lái)源EPC的分離、培養(yǎng)和鑒定：采用密度梯度離心法，從人骨髓中分離單個(gè)核細(xì)胞；采用差速貼壁培養(yǎng)法，從人骨髓分離出的單個(gè)核細(xì)胞中，培養(yǎng)、擴(kuò)增EPC。主要從細(xì)胞形態(tài)學(xué)、對(duì)比應(yīng)用多種內(nèi)皮細(xì)胞的特征標(biāo)記及功能檢測(cè)等方面證實(shí)所獲細(xì)胞為EPC,完成細(xì)胞

6、鑒定，為下一步研究提供基礎(chǔ)。
　　 2、OPN促進(jìn)EPC的增殖作用及機(jī)制初探：對(duì)培養(yǎng)出的EPC用免疫組化及RT-PCR方法檢測(cè)OPN蛋白及mRNA水平的表達(dá)，并用不同濃度(0.5，1，2，4ug/ml)OPN進(jìn)行干預(yù)，CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖水平。將PI3K抑制劑——LY294002和AKT抑制劑——AKT inhibitor預(yù)處理過(guò)的EPC加入OPN檢測(cè)其增殖水平來(lái)初步探討OPN對(duì)EPC增殖作用的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制。
　　

7、3、檢測(cè)乳癌患者OPN表達(dá)與循環(huán)EPC數(shù)量的相關(guān)性：流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)循環(huán)EPC，ELISA法檢測(cè)血漿中OPN濃度，免疫組化法檢測(cè)癌組織OPN的表達(dá)，評(píng)估乳腺癌中循環(huán)EPC數(shù)量與不同乳癌病理特點(diǎn)、血漿OPN濃度、癌組織OPN表達(dá)之間的相關(guān)性。
　　 結(jié)果：
　　 1、從人骨髓細(xì)胞中可分離培養(yǎng)出EPC。從人骨髓中分離出的細(xì)胞懸液經(jīng)密度梯度離心后，可分離出骨髓來(lái)源的單個(gè)核細(xì)胞(bone marrow-derived mononu

8、clear cell，BMNC)；經(jīng)差速貼壁法培養(yǎng)后，可獲得EPC。細(xì)胞呈梭狀，可形成集落，符合祖細(xì)胞特性；培養(yǎng)15天左右，可形成典型“鋪路石”樣內(nèi)皮細(xì)胞。細(xì)胞表達(dá)CD34，KDR，CD133等分子標(biāo)記，培養(yǎng)的細(xì)胞可吞噬Dil-acLDL，可結(jié)合UEA-1。
　　 2、OPN促進(jìn)EPC增殖，且呈濃度依賴(lài)性。EPC本身可以表達(dá)OPN，加入培養(yǎng)基的VEGF，bFGF均可以增加EPC中OPN mRNA水平。加入外源性O(shè)PN不能增加EP

9、C內(nèi)源性O(shè)PN mRNA水平。將不同濃度(0.5，1，2，4ug/ml)的人重組OPN加入基礎(chǔ)培養(yǎng)液中進(jìn)行干預(yù)，EPC增殖功能增強(qiáng)，且隨EPC濃度的增加而增加，預(yù)先加入的LY294002和AKT inhibitor都抑制了OPN誘導(dǎo)的EPC增殖。顯示：OPN通過(guò)PI3K/Akt信號(hào)通路促進(jìn)EPC的增殖。
　　 3、乳腺腫瘤患者外周血中EPC數(shù)量和血漿OPN濃度及二者相關(guān)性檢測(cè)。轉(zhuǎn)移性乳腺癌(11例)外周血中成血-血管干細(xì)胞源性?xún)?nèi)

10、皮祖細(xì)胞即CD45neg-dim/CD34+/KDR+內(nèi)皮祖細(xì)胞(中位數(shù)為65/ml，四分位數(shù)間距：32.0-92.0/ml)高于早期乳腺癌(29例)(中位數(shù)為35/ml，四分位數(shù)間距：7.0-56.5/ml)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。早期乳腺癌外周血中CD45neg-dim/CD34+/KDR+內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量與良性乳腺病變(9例)(中位數(shù)為13/ml，四分位間距：1.5-45.5/ml)相比，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差別。乳腺癌外周血中髓系祖細(xì)胞源性?xún)?nèi)皮祖

11、細(xì)胞CD45+/KDR+單核細(xì)胞數(shù)量高于乳腺良性病變(473.45±201.63 cells/ml比319.78±183.52 cells/ml；P＜0.05)；但不隨乳腺癌分期越高而增加。CD45neg-dim/CD34+/KDR+EPC在＞3cm乳腺癌中為56.5/ml(四分位數(shù)間距：37.5-77.0/ml)，高于＜3cm乳腺癌：27.5/ml(四分位數(shù)間距：7.5-61.0/ml)，P＜0.05。而CD45+/KDR+單核細(xì)胞數(shù)

12、量在兩組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差別(P=0.055)。組織分級(jí)G3乳腺癌患者CD45neg-dim/CD34+/KDR+ EPC數(shù)量為68.0/ml(IQR：38.50-96.50/ml)與G2乳腺癌(29.5/ml，IQR：8.50-50.25/ml)比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差別(P=0.008)，而G1和G2比較，G1和G3比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差別(P=0.788；P=0.138)。乳腺癌病人血漿中OPN與VEGF的濃度分別為7.9615±1.7026 pg/ml

13、和401.49±86.71 pg/ml，二者均高于乳腺良性病變患者血漿中的OPN與VEGF的濃度(6.2922±2.0795 pg/ml；170.73±29.04pg/ml)P＜0.05。在早期與轉(zhuǎn)移性乳腺癌中未見(jiàn)二者濃度有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的不同。在乳腺癌病人血漿中，我們沒(méi)有發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)細(xì)胞因子濃度有相關(guān)性，也沒(méi)有發(fā)現(xiàn)他們與外周血中兩個(gè)EPC細(xì)胞群之間有相關(guān)性。癌組織OPN的表達(dá)也未發(fā)現(xiàn)與外周血循環(huán)中的EPC數(shù)量相關(guān)。
　　 結(jié)論：