骨橋蛋白對內皮祖細胞增殖作用和機制及二者在乳腺癌中相關性的研究.pdf

1、傳統(tǒng)觀點認為，成體中血管再生和改建僅由鄰近血管內皮細胞增殖和爬行這種“血管新生(angiogenisis)”方式來實現(xiàn)。1997年，Asahara等首次在Science上提出內皮祖細胞(endothelial progenitor cell，EPC)并證實EPC具有在體內外增殖、遷徙、分化為成熟內皮細胞形成血管的能力。隨后大量研究證實，成體新生血管除了血管新生方式外，還可以由干細胞分化成能定向分化為內皮細胞的前體細胞EPC，再分化為成熟

2、血管內皮細胞，形成血管的“血管生成(vasculogenesis)”方式來實現(xiàn)。腫瘤生長、侵襲、轉移均為血管生成依賴性的。研究表明，EPC的增生與分化是腫瘤血管形成的關鍵步驟，EPC是內皮細胞的前體細胞，在腫瘤新生血管形成中占有重要地位。當前，EPC的分離、培養(yǎng)、鑒定，體內分布、來源、分化、遷徙、歸巢、功能及應用等方面正被廣泛而深入的研究。本研究第一部分，對從人骨髓分離、培養(yǎng)、擴增出的EPC及細胞鑒定進行探討。
　　 某些類型腫

3、瘤中，腫瘤負荷，組織學分級，病理分期，預后與外周血循環(huán)EPC數(shù)量明顯相關。腫瘤分泌VEGF，SDF-1，G-CSF，GM-CSF等多種細胞因子和趨化因子調控EPC的動員、增生、遷移、分化及歸巢功能。骨橋蛋白(osteopontin，OPN)稱為“惡性轉化相關因子”。腫瘤組織和血漿血清中高表達OPN的乳腺癌患者容易發(fā)生轉移，預后不良。研究發(fā)現(xiàn)OPN作為成血管因子，與腫瘤血管形成相關。OPN在腫瘤中的高表達與腫瘤血管密度(MVD)相關，Ta

4、kahashi F等研究發(fā)現(xiàn)OPN在體外可以促進人臍靜脈內皮細胞增殖，提示了OPN有可能通過血管形成的參與者內皮細胞來提高腫瘤血管形成，從而有利于腫瘤生長與轉移。但是OPN對于EPC的增殖作用及其機制未見報道。OPN是否能夠促進腫瘤血管形成的重要參與者內皮細胞的前體細胞EPC增殖，從而在祖細胞水平，也即有很強的集落形成能力的細胞階段使其數(shù)量大為擴增，而形成用以滿足腫瘤生長與轉移所必需的大量營養(yǎng)物質的新生血管的作用及機制需要深入研究。

5、r>　　 目的：探討從人骨髓中分離、培養(yǎng)EPC的方法。觀察OPN對EPC的增殖作用并初步探索其作用機制，以及檢測乳癌OPN表達與循環(huán)EPC數(shù)量的相關性。
　　 方法：
　　 1、人骨髓來源EPC的分離、培養(yǎng)和鑒定：采用密度梯度離心法，從人骨髓中分離單個核細胞；采用差速貼壁培養(yǎng)法，從人骨髓分離出的單個核細胞中，培養(yǎng)、擴增EPC。主要從細胞形態(tài)學、對比應用多種內皮細胞的特征標記及功能檢測等方面證實所獲細胞為EPC,完成細胞

6、鑒定，為下一步研究提供基礎。
　　 2、OPN促進EPC的增殖作用及機制初探：對培養(yǎng)出的EPC用免疫組化及RT-PCR方法檢測OPN蛋白及mRNA水平的表達，并用不同濃度(0.5，1，2，4ug/ml)OPN進行干預，CCK-8法檢測細胞增殖水平。將PI3K抑制劑——LY294002和AKT抑制劑——AKT inhibitor預處理過的EPC加入OPN檢測其增殖水平來初步探討OPN對EPC增殖作用的信號傳導機制。
　　

7、3、檢測乳癌患者OPN表達與循環(huán)EPC數(shù)量的相關性：流式細胞儀計數(shù)循環(huán)EPC，ELISA法檢測血漿中OPN濃度，免疫組化法檢測癌組織OPN的表達，評估乳腺癌中循環(huán)EPC數(shù)量與不同乳癌病理特點、血漿OPN濃度、癌組織OPN表達之間的相關性。
　　 結果：
　　 1、從人骨髓細胞中可分離培養(yǎng)出EPC。從人骨髓中分離出的細胞懸液經密度梯度離心后，可分離出骨髓來源的單個核細胞(bone marrow-derived mononu

8、clear cell，BMNC)；經差速貼壁法培養(yǎng)后，可獲得EPC。細胞呈梭狀，可形成集落，符合祖細胞特性；培養(yǎng)15天左右，可形成典型“鋪路石”樣內皮細胞。細胞表達CD34，KDR，CD133等分子標記，培養(yǎng)的細胞可吞噬Dil-acLDL，可結合UEA-1。
　　 2、OPN促進EPC增殖，且呈濃度依賴性。EPC本身可以表達OPN，加入培養(yǎng)基的VEGF，bFGF均可以增加EPC中OPN mRNA水平。加入外源性OPN不能增加EP

9、C內源性OPN mRNA水平。將不同濃度(0.5，1，2，4ug/ml)的人重組OPN加入基礎培養(yǎng)液中進行干預，EPC增殖功能增強，且隨EPC濃度的增加而增加，預先加入的LY294002和AKT inhibitor都抑制了OPN誘導的EPC增殖。顯示：OPN通過PI3K/Akt信號通路促進EPC的增殖。
　　 3、乳腺腫瘤患者外周血中EPC數(shù)量和血漿OPN濃度及二者相關性檢測。轉移性乳腺癌(11例)外周血中成血-血管干細胞源性內

10、皮祖細胞即CD45neg-dim/CD34+/KDR+內皮祖細胞(中位數(shù)為65/ml，四分位數(shù)間距：32.0-92.0/ml)高于早期乳腺癌(29例)(中位數(shù)為35/ml，四分位數(shù)間距：7.0-56.5/ml)，差異有統(tǒng)計學意義。早期乳腺癌外周血中CD45neg-dim/CD34+/KDR+內皮祖細胞數(shù)量與良性乳腺病變(9例)(中位數(shù)為13/ml，四分位間距：1.5-45.5/ml)相比，無統(tǒng)計學差別。乳腺癌外周血中髓系祖細胞源性內皮祖

11、細胞CD45+/KDR+單核細胞數(shù)量高于乳腺良性病變(473.45±201.63 cells/ml比319.78±183.52 cells/ml；P＜0.05)；但不隨乳腺癌分期越高而增加。CD45neg-dim/CD34+/KDR+EPC在＞3cm乳腺癌中為56.5/ml(四分位數(shù)間距：37.5-77.0/ml)，高于＜3cm乳腺癌：27.5/ml(四分位數(shù)間距：7.5-61.0/ml)，P＜0.05。而CD45+/KDR+單核細胞數(shù)

12、量在兩組無統(tǒng)計學差別(P=0.055)。組織分級G3乳腺癌患者CD45neg-dim/CD34+/KDR+ EPC數(shù)量為68.0/ml(IQR：38.50-96.50/ml)與G2乳腺癌(29.5/ml，IQR：8.50-50.25/ml)比較有統(tǒng)計學差別(P=0.008)，而G1和G2比較，G1和G3比較均無統(tǒng)計學差別(P=0.788；P=0.138)。乳腺癌病人血漿中OPN與VEGF的濃度分別為7.9615±1.7026 pg/ml

13、和401.49±86.71 pg/ml，二者均高于乳腺良性病變患者血漿中的OPN與VEGF的濃度(6.2922±2.0795 pg/ml；170.73±29.04pg/ml)P＜0.05。在早期與轉移性乳腺癌中未見二者濃度有統(tǒng)計學上的不同。在乳腺癌病人血漿中，我們沒有發(fā)現(xiàn)這兩個細胞因子濃度有相關性，也沒有發(fā)現(xiàn)他們與外周血中兩個EPC細胞群之間有相關性。癌組織OPN的表達也未發(fā)現(xiàn)與外周血循環(huán)中的EPC數(shù)量相關。
　　 結論：