基于實(shí)時(shí)PCR的多靶檢測(cè)技術(shù)研究.pdf

1、作為重要的均相檢測(cè)技術(shù)，實(shí)時(shí)PCR因具有快速、簡(jiǎn)便、靈敏、特異、可定量等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)研究和醫(yī)學(xué)研究等領(lǐng)域。然而，受目前實(shí)時(shí)PCR儀可檢測(cè)的熒光通道數(shù)目的限制，實(shí)時(shí)PCR存在檢測(cè)容量小的問(wèn)題，難以在單次反應(yīng)中檢測(cè)多個(gè)靶序列。針對(duì)這個(gè)問(wèn)題，本論文對(duì)實(shí)時(shí)PCR多靶檢測(cè)技術(shù)展開(kāi)了研究，研究工作主要包括對(duì)多色組合探針編碼技術(shù)的研究及探針熔解曲線分析技術(shù)的研究。 第一部分，提出了多色組合探針編碼技術(shù)，并考察了該技術(shù)分別用于

2、多靶識(shí)別和多突變檢測(cè)的可行性。在該部分第一章，以多種食源性致病菌為檢測(cè)對(duì)象，利用改良分子信標(biāo)作為檢測(cè)探針，將多色組合探針編碼技術(shù)用于八種食源性致病菌的識(shí)別，所建立的檢測(cè)體系可以準(zhǔn)確識(shí)別八種食源性致病菌的任意一種，具有快速、簡(jiǎn)便、通量高、特異性好等優(yōu)點(diǎn)。第二章，詳細(xì)考察了熒光雙鏈置換探針受Taq DNA聚合酶的5'→3'核酸外切酶活性的影響及其規(guī)律，為多色組合探針編碼技術(shù)用于多種突變的檢測(cè)打下基礎(chǔ)。第三章，以β-珠蛋白基因多種突變?yōu)闄z測(cè)對(duì)

3、象，通過(guò)結(jié)合HAND系統(tǒng)和熒光雙鏈置換探針技術(shù)，將多色組合探針編碼技術(shù)用于多種突變的檢測(cè)，在單個(gè)反應(yīng)管中實(shí)現(xiàn)對(duì)5種中國(guó)常見(jiàn)β-地中海貧血突變的檢測(cè)和21種基因型的分型。 第二部分，發(fā)展了新的探針熔解曲線分析技術(shù)。多色熒光檢測(cè)和Tm多重檢測(cè)是實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)PCR多靶檢測(cè)的有力工具。然而，目前的熒光探針具有難以同時(shí)結(jié)合多色熒光檢測(cè)和Tm多重檢測(cè)的缺陷。因此，在該部分第一章，首先系統(tǒng)考察了目前常用的熒光探針用于熔解曲線分析的可行性，比較各探