實時熒光PCR技術(shù)檢測奶制品摻假方法研究.pdf

1、目的：運用實時熒光PCR技術(shù)建立奶制品中主成分牛、羊及其常見摻假成分谷類、大米、大豆源性成分的定性檢測體系,以鑒別檢測奶制品相關(guān)摻假;并在定性的基礎(chǔ)上探索奶粉中牛源性主成分的定量檢測方法。
　　方法：⑴奶制品摻假定性檢測體系研究:分別以牛的線粒體細胞色素 b基因、羊的線粒體12SrRNA基因為靶基因設(shè)計合成牛、羊源性引物探針,以常見摻加物大米、玉米、小麥、高粱、大麥等谷物的葉綠體rbcL基因作為靶基因通過BLAST軟件比對選擇其同

2、源保守區(qū)域設(shè)計合成谷類通用性引物探針、以水稻的根部表達基因(gos9)設(shè)計合成大米特異性引物探針、以大豆凝集素基因(lectin)為靶基因設(shè)計合成大豆特異性引物探針,建立奶類摻假實時熒光PCR檢測體系。經(jīng)對目標成分與奶制品中常添加的非目標成分檢測以驗證其通用性和特異性,用10倍倍比稀釋的目標成分的DNA模板檢驗其靈敏度,以自制模擬奶類樣品檢測其在模擬樣品檢測中的靈敏度及抗干擾能力,并進一步經(jīng)市售奶類樣品檢測驗證其應(yīng)用檢測能力。⑵奶粉中牛

3、源性主成分定量研究:采用實時熒光PCR技術(shù)以牛的線粒體細胞色素b基因為靶基因建立不同質(zhì)量百分比的牛奶粉標準品中的主成分含量與相應(yīng)Ct值間的定量標準曲線方程,利用標準曲線計算出奶粉中主成分的質(zhì)量分數(shù)。經(jīng)回收率實驗對該方法的準確性進行評估,并將其用于市售嬰幼兒奶粉樣品的檢測以驗證其可行性。
　　結(jié)果：①所建立的牛、羊源性主成分定性檢測體系在35個循環(huán)之內(nèi)只有目標成分出現(xiàn)陽性擴增,而與其他非目標成分均無交叉擴增,特異性好。靈敏度分別為0

4、.1ng、0.01ng的模板DNA,1％(w/w)、0.5％(w/w)的模擬樣品。進一步經(jīng)市售樣品檢測驗證,只對含目標成分的奶制品擴增陽性,檢測結(jié)果均與食品標簽相符。②所建立的谷類通用檢測體系在35個循環(huán)內(nèi),大米、大豆源性檢測體系在40個循環(huán)內(nèi),只針對目標成分進行擴增,與其它非目標成分均無交叉擴增,通用性和特異性好,靈敏度分別為0.01ng、0.1ng、0.1ng的目標DNA,0.5％(w/w)、0.1％(w/w)、0.5％(w/w)的

5、模擬樣品,進一步經(jīng)市售奶類樣品檢測驗證,1份樣品被檢測出含大豆成分,其它結(jié)果均與食品標簽相符。③奶粉中牛源性主成分定量研究:本研究建立的定量標準曲線方程為:y=-0.057x+32.759,相關(guān)系數(shù)R為0.964,回收率在109％~134％之間,8份市售奶粉樣品中檢測出3份樣品的牛奶含量低于50％,該3份樣品進一步經(jīng)谷類、大米、大豆定性檢測體系檢測,證實其中有1份樣品被非法摻入了非大米谷類源性成分而另2份樣品中未檢測出非法摻入谷物、大米