一個遺傳性血管性血友病家系的實驗室診斷和分子發(fā)病機制研究.pdf

1、血管性血友病(von Willebrand disease，vWD)是由于血管性血友病因子(vonWillebrand fcator，VWF)缺乏或功能異常所致的出血性疾病。根據(jù)發(fā)病原因分為遺傳性和獲得性兩大類。遺傳性血管性血友病主要為常染色體顯性遺傳，少數(shù)為隱性遺傳。遺傳性vWD的不同分類及亞型分型具有不同的分子發(fā)病機制。研究該病的分子發(fā)病機制，有助于了解VWF蛋白的結構與功能的關系，對于臨床診斷、治療和預后都有重要的意義。
　

2、　 目的：采用一系列vWD診斷實驗、分型實驗，對一個出血性疾病患者及其家系明確診斷，并對先證者及家系受累成員的血管性血友病因子(VWF)基因進行分析，探討其發(fā)病機制。
　　 方法：
　　 一)應用酶聯(lián)免疫吸附法(Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA)、瑞斯托霉素誘導的血小板聚集實驗(Ristocetin Induced Platelet Aggregation，RIPA)及VW

3、F多聚體電泳等方法分析vWD患者家系三代6位成員臨床表型。
　　 二)PCR擴增先證者及家系成員的VWF基因的52個外顯子及其側翼序列并測序，通過Chromas軟件將測序結果與NM_000552.3序列進行比對。根據(jù)檢測到的突變位點，以含VWF全長cDNA的表達質粒(pSVVWF)為模板，采用定點突變的方法構建突變質粒pSVVWFdel6。將野生型VWF質粒(wt-pSVVWF)和突變型VWF質粒(pSVVWFdel6)轉染HE

4、K293細胞。收集瞬時轉染后的上清和細胞裂解液。轉染后的上清以40倍的比例濃縮。ELISA法檢測細胞上清及細胞裂解液中VWF抗原含量，并采用多聚體電泳法對細胞上清進行VWF多聚體分析。
　　 結果：
　　 1、先證者的血漿VWF：Ag為20.5％，血漿FVIII：C為25.0％，VWF：RCo為6.2％，RIPA為28.5％，VWF：CB為3.8％，以上結果均明顯低于正常參考值。血漿VWF多聚體分析顯示大分子量多聚體缺乏

5、，而血小板VWF多聚體分析無異常。同時先證者VWF：Ag/VWF：CB>2，這與以往報道相一致。
　　 2、與先證者有相似癥狀的四位家系成員的血漿VWF：Ag、VWF：RCo、FVIII：C、RIPA、VWF：CB均明顯低于正常范圍，同時血漿VWF多聚體分析顯示大分子量多聚體缺乏，血小板VWF多聚體分析無異常。
　　 3、先證者的VWF基因52個外顯子及其側翼序列擴增測序，發(fā)現(xiàn)第28號外顯子存在雜合的6個堿基GATGTG

6、的缺失，導致VWF A2區(qū)的氨基酸D1529-V1530缺失，其四位受累家系成員測序結果也有相同的基因的改變。為確定所發(fā)現(xiàn)的VWF基因缺失這一改變屬基因突變還是基因多態(tài)性，我們共檢測了68位正常人的VWF基因的第28號外顯子基因，未見該基因改變。
　　 4、野生型及突變型VWF表達載體轉染HEK293細胞后，檢測細胞裂解液中VWF抗原含量，突變型與野生型無明顯差異；而細胞培養(yǎng)上清中，單轉突變體的細胞上清VWF含量顯著降低，約為野

7、生型的26.89±4.64％，共轉突變型和野生型的細胞上清中VWF含量也顯著降低，為野生型的37.83±5.29％，VWF多聚體分析突變型濃縮上清中VWF大分子量多聚體缺如。
　　 結論：
　　 1、根據(jù)先證者及受累家系成員臨床癥狀、體征以及VWF相關實驗室檢查，可明確診斷為2A型vWD。
　　 2、基因分析發(fā)現(xiàn)先證者及其他4位家系成員的VWF A2結構域內一雜合的6個堿基GATGTG的缺失，從而導致氨基酸D15