組織工程脂肪移植預(yù)防硬膜外瘢痕形成.pdf

1、目的：前脂肪細(xì)胞能定向分化為成熟脂肪細(xì)胞，而纖維蛋白凝膠與多種細(xì)胞都具有良好的生物相容性。體外實驗證明：前脂肪細(xì)胞可在纖維蛋白凝膠中有效黏附、增殖并誘導(dǎo)分化為成熟的脂肪細(xì)胞，因此本次實驗將前脂肪細(xì)胞與纖維蛋白凝膠復(fù)合物植入體內(nèi)，探索前脂肪細(xì)胞在體內(nèi)增殖、分化的可行性。從而為組織工程脂肪移植預(yù)防硬膜外瘢痕形成提供理論基礎(chǔ)。本實驗研究的目的就是；體外分離培養(yǎng)大鼠的前脂肪細(xì)胞并與纖維蛋白凝膠復(fù)合，回植入大鼠椎板缺損區(qū)，探索其復(fù)合體植入大鼠體內(nèi)

2、預(yù)防硬膜外瘢痕形成的效果． 方法: （1）將80只大鼠隨機(jī)分成4組。A組為前脂肪細(xì)胞-纖維蛋白凝膠支架復(fù)合物植入組。B組為自體脂肪顆粒與纖維蛋白凝膠混合物植入組。C組單純自體脂肪顆粒植入組。D組為空白對照。 （2）大鼠前脂肪細(xì)胞的培養(yǎng)：將A組大鼠分別于10%水合氯醛腹腔注射麻醉（0．35 mg/100g）后。無菌取出附睪部腹股溝部脂肪組織。剪去脂肪組織中較大的血管和結(jié)締組織，用眼科剪將附睪部和腹股溝部混和脂肪組織

3、剪成1 mm3左右的碎塊。加入膠原酶消化液，37℃消化1小時，每五分鐘振蕩一次。通過孔徑為100um和25um的尼龍篩，收取過濾液離心10分鐘（600g）。棄去上清液，加入紅細(xì)胞裂解液，吹打均勻，室溫靜置10分鐘。再次離心5分種，棄去上清液，加入無血清培養(yǎng)液，吹打均勻，重復(fù)一次即得到前脂肪細(xì)胞。將前脂肪細(xì)胞消化傳代至底面積為25c㎡培養(yǎng)瓶中，加入完全培養(yǎng)液（DMEM+10%FBS+100U/ml青、鏈霉素），在37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱（5%CO

4、2）中培養(yǎng)，每兩天更換培養(yǎng)液一次，培養(yǎng)細(xì)胞至實驗所需數(shù)量。 （3）前脂肪細(xì)胞與纖維蛋白凝膠混合物的制備。先將培養(yǎng)瓶中生長狀況良好處于對數(shù)生長期內(nèi)的前脂肪細(xì)胞用0．25%的胰酶消化、離心，再用細(xì)胞記數(shù)板顯微鏡下計數(shù)，然后用含10%胎牛血清及誘導(dǎo)分化劑的DMEM培養(yǎng)液制作成密度為1×105/ml的單細(xì)胞懸液備用。將纖維蛋白原加入含血清DMEM培養(yǎng)液充分溶解，配制成為75mg/ml纖維蛋白原溶液，凝血酶用含40mmol/L氯化鈣的溶解

5、液溶解，使其最后凝血酶濃度為100u/ml。向24孔培養(yǎng)板每孔滴入前脂肪細(xì)胞懸液100ul，加入預(yù)溫至37℃的纖維蛋白原200ul，然后加入凝血酶溶液100ul，震蕩混勻后將培養(yǎng)板放入37℃培養(yǎng)箱內(nèi)數(shù)分鐘即見凝膠形成。每孔再加入培養(yǎng)液，置于培養(yǎng)箱內(nèi)，待植入A組大鼠椎板缺損區(qū)。 （4）組織工程脂肪的體內(nèi)實驗。 1）動物椎板缺損模型制備及組織工程脂肪的移植：各組的SD大鼠均以10%水合氯醛腹腔麻醉后，無菌條件下手術(shù)。取背部正

6、中縱行切口，切除L1-L3棘突及全椎板，造成0．3cm×1．0cm椎板缺損，切除黃韌帶，清除硬膜外脂肪，保留完整硬膜。制成椎板缺損模型。徹底止血后，清除所有顯微鏡下所能見到的軟組織纖維狀物及碎骨片，A組植入前脂肪細(xì)胞-纖維蛋白凝膠支架復(fù)合物，B組植入自體脂肪顆粒與纖維蛋白凝膠混合物，C組植入單純自體脂肪顆粒，D組為空白對照。植入時以鋪滿缺損區(qū)域為宜，關(guān)閉切口后，定期觀察椎板缺損區(qū)的瘢痕組織情況。 2）標(biāo)本制作、觀察項目、檢測方法

7、及指標(biāo)。（1）大體觀察：分別在術(shù)后4、8、12周各取3只大鼠，在手術(shù)顯微鏡下按原手術(shù)入路進(jìn)行解剖觀察。將肉眼看到的硬膜外瘢痕按照改良Rydell-Balazs標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行粘連程度評分。（2）光鏡觀察。取材時間點同上，每組每次4只動物。完整取出手術(shù)段脊柱，置入10%的硝酸-福爾馬林混合液溶液中固定3d，再用50%的甲酸在室溫下脫鈣，然后標(biāo)本中段取材，常規(guī)脫水與石蠟包埋，5μm的連續(xù)切片，每個標(biāo)本切片2張，其中1張行HE染色，光鏡下觀察，按改良

8、Nussbaum標(biāo)準(zhǔn)行組織學(xué)評分。1張行VG染色，觀察瘢痕中膠原的性質(zhì)及其分布。（3）電鏡觀察。8周時在顯微鏡下切取各組大體標(biāo)本之硬膜外瘢痕，約1mm × 1．5mm×2mm大小，經(jīng)戊二醛固定后制作超薄切片，用透射電鏡下觀察其超微結(jié)構(gòu)。 結(jié)果：從大鼠身上成功的分離并培養(yǎng)出前脂肪細(xì)胞，在體外大量擴(kuò)增，光學(xué)顯微鏡下觀察可見前脂肪細(xì)胞在纖維蛋白凝膠上具有良好的黏附，生長能力。分離純化的大鼠前脂肪細(xì)胞與纖維蛋白凝膠復(fù)合植入大鼠椎板缺損區(qū)