抗AMP單抗的制備及牛奶中AMP殘留ELISA檢測方法的建立.pdf

1、氨芐青霉素(簡稱AMP)屬于β-內(nèi)酰胺類抗生素，是廣譜半合成青霉素，抗菌譜比青霉素G廣，對G<'+>菌和G<'->菌均有較高的抗菌活性，是禽畜等農(nóng)產(chǎn)品養(yǎng)殖中常用的抗生素類藥物之一，在奶牛的飼養(yǎng)過程中青霉素藥渣常被作為飼料添加劑和廣泛應(yīng)用于治療奶牛的乳腺炎，尿道、生殖道、胃腸道呼吸系統(tǒng)等感染，從而造成牛奶中的殘留，會給人們的健康和奶類發(fā)酵品的生產(chǎn)帶來很大危害。因此，建立牛奶中氨芐青霉素殘留快速檢測方法具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。本研究在制備AMP

2、人工抗原的基礎(chǔ)上，研制抗AMP單克隆抗體，建立AMP殘留檢測酶聯(lián)免疫檢測方法(ELISA)。主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下： (1) 采用戊二醛法和物理法將氨芐青霉素分別與牛血清白蛋白 (BSA)、卵清蛋白 (OVA) 兩種載體蛋白偶聯(lián)，制備免疫用和ELISA檢測用抗原。以紫外掃描和SDS-PAGE電泳鑒定偶聯(lián)成功。 應(yīng)用L9(3<'4>)正交試驗(yàn)確定戊二醛法的最佳制備條件為：AMP與BSA的起始摩爾比 40：1，25％戊二醛量10μ

3、l，反應(yīng)時(shí)間4h；物理法的AMP與BSA最適起始摩爾比為 20：1，反應(yīng)時(shí)間3h。 采用自行改良的BCA-紫外結(jié)合法測定最佳條件下制備的AMP人工抗原的偶聯(lián)比，結(jié)果為戊二醛法制備的AMP人工抗原平均偶聯(lián)比為10.23，物理法制備的AMP人工抗原平均偶聯(lián)比為 17.68。物理法制備的AMP人工抗原的偶聯(lián)比要明顯高于戊二醛法。 (2) 將兩種方法制備的人工抗原各免疫3只小鼠，四次免疫之后通過間接ELISA法測定各小鼠的效價(jià)達(dá)

4、到1～5×10<'4>，以100ng/mL的AMP標(biāo)品進(jìn)行間接競爭ELISA實(shí)驗(yàn)，測定各血清各小鼠均呈現(xiàn)不同程度的阻斷抑制，其中②號小鼠對的抑制率達(dá)到 93.4％，敏感性最高。采用物理法制備的AMP人工抗原免疫小鼠后的抗血清對AMP標(biāo)品的抑制率高于戊二醛法。 運(yùn)用雜交瘤技術(shù)選用②號小鼠的脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞融合，融合孔率為21％，陽性孔率為 5.4％。應(yīng)用有限稀釋法進(jìn)行亞克隆，篩選到3個(gè)穩(wěn)定分泌抗氨芐青霉素單抗的

5、克隆，依次是X.5.2，X.16.3.5和X.16.4.8。挑選陽性最高、敏感性也最好的X.16.3.5克隆注射到小鼠體內(nèi)制備腹水。 采用辛酸-飽和硫酸銨法純化腹水，純化后抗體蛋白濃度為5.85mg/ml。間接 ELISA 測定腹水效價(jià)為3.2×10<'5>，IC<,50>值約為12.5ng/ml，與載體蛋白OVA、BSA無交叉反應(yīng)，與抗生素類藥物慶大霉素、四環(huán)素、卡拉霉素、鏈霉素?zé)o交叉反應(yīng)。篩選出的單克隆敏感性和特異性較高。

6、 (3) 對ELISA各個(gè)條件進(jìn)行了選擇和優(yōu)化。以 PH8.0的Tris-HCL 緩沖液為基質(zhì)，應(yīng)用間接競爭 ELISA 方法建立了檢測AMP的標(biāo)準(zhǔn)曲線，檢測線性范圍為：0.5～500 ng/ml，回歸方程為Y=32.539X+13.651，相關(guān)系數(shù)R<'2>=0.982，靈敏度和最低檢測線分別為 13.09 ng/ml和0.77 ng/ml，批內(nèi)和批間的變異系數(shù)分別為4.45％和5.80％，重現(xiàn)性較好。 以緩沖液溶解的5

7、％的脫脂牛奶為基質(zhì)，成功建立了牛奶中檢測AMP殘留的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到的回歸方程為 Y=30.427X+13.773，線性范圍為0.5～500ng/ml，相關(guān)系數(shù) R<'2>= 0.9904，靈敏度和最低檢測線分別為 15.51 ng/ml 和0.75ng/ml。建立該檢測方法的精密度實(shí)驗(yàn)，批內(nèi)變異系數(shù)為4.35％<5％、批間變異系數(shù)5.70％<10％，對牛奶的5個(gè)水平的加標(biāo)實(shí)驗(yàn)的平均回收率為 93.64％，該方法的最低檢測限能達(dá)到歐盟標(biāo)準(zhǔn)