抗重金屬Hg2+單抗制備及ELISA檢測方法的建立.pdf

1、重金屬汞（Hg）既是人們生產(chǎn)生活的必需重要元素，也是嚴重危害環(huán)境的元素之一。隨著汞的廣泛使用，其對環(huán)境的污染越來越嚴重，通過食物鏈進行循環(huán)富集作用，給人類健康構(gòu)成威脅。鑒于傳統(tǒng)的儀器檢測方法存在成本貴、實驗要求高等諸多缺點，本文通過細胞融合技術(shù)制備抗汞離子單克隆抗體，結(jié)合免疫學技術(shù)原理方法，建立了ELISA檢測方法，進一步完善了重金屬汞離子的檢測方法，為臨床環(huán)境或畜產(chǎn)品中批量、快速、高效檢測提供有效支持。
　　為建立汞離子免疫學檢

2、測方法，通過分析重金屬汞離子結(jié)構(gòu)特征，采用異硫氰酯法將雙功能螯合劑ITCBE與汞離子螯合形成半抗原，然后將其與牛血清白蛋白（BSA）和卵清蛋白（0VA）偶聯(lián)合成人工免疫原Hg2+-ITCBE-BSA和包被原Hg2+-ITCBE-OVA，用紫外（UV）、電感耦合等離子體質(zhì)譜法（ICP-MS）和凝膠電泳（SDS-PAGE）進行鑒定；用Hg2+-ITCBE-BSA免疫BALB/C小鼠，間接ELISA測定多抗（pAb）效價，阻斷 ELISA鑒定

3、其敏感性，交叉反應(yīng)試驗鑒定其特異性。結(jié)果表明，免疫原Hg2+-ITCBE-BSA和包被原 Hg2+-ITCBE-OVA制備成功。Hg2+-ITCBE-BSA中 BSA和Hg2+的含量分別為9.09 g/L和45.88 mg/L；間接ELISA效價達到1∶（1.024×105），阻斷ELISA檢測Hg-EDTA的IC50為45.49 ng/mL。成功制備汞離子人工完全免疫原。
　　用Hg2+-ITCBE-BSA免疫Balb/C小鼠，

4、通過ELISA篩選出間接效價最高、阻斷效價最低的小鼠，無菌制備脾臟細胞，與骨髓瘤細胞進行細胞融合。通過檢測細胞培養(yǎng)上清效價和抑制效價，篩選出兩株高靈敏性的雜交瘤細胞株3B1E5、2G6C3。通過誘生腹水法獲取大量單抗，并對其免疫學特性進行鑒定。結(jié)果表明，3B1E5細胞株效價最好，間接效價達到1∶（5.12×105），同種型鑒定為IgG2/κ，IC50分別為29.99 ng/mL，單抗親和常數(shù)Ka為9.1×1010 L/mol，與其他重金

5、屬無交叉反應(yīng)。成功獲得高特異性單克隆抗體。
　　用3B1E5株產(chǎn)生的單抗組裝建立了重金屬汞離子阻斷ELISA檢測試劑盒。用方陣法對包被濃度、單抗工作濃度、酶工作濃度參數(shù)進行優(yōu)化，建立 ELISA檢測方法并建立繪制標準曲線，推導線性回歸方程，確定靈敏度及檢測限，并對其性能進行測定。結(jié)果表明，該試劑盒的靈敏度為12.42 ng/mL，檢測限為4.97 ng/mL，添加回收試驗和批內(nèi)批間試驗的變異系數(shù)均小于15％，表明其準確度和精密度都