環(huán)鳥(niǎo)苷酸(cGMP)免單抗的制備及競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)定方法的建立.pdf

1、環(huán)鳥(niǎo)苷酸(Guanosine3'，5'-cyclic monophosphate，cGMP)和環(huán)腺苷酸(Adenosine3'，5'-cyclic monophosphate，cAMP)是細(xì)胞內(nèi)的第二信使，是原核生物和真核生物中重要的信號(hào)通路分子。cGMP對(duì)細(xì)胞內(nèi)多種代謝途徑產(chǎn)生影響。cGMP可以降低心肌代謝，收縮力和功能，參與干細(xì)胞的增殖與分化，抑制糖異生以及興奮副交感神經(jīng)。cGMP對(duì)視覺(jué)信號(hào)傳導(dǎo)、平滑肌和骨骼肌、神經(jīng)系統(tǒng)功能、血小板

2、活化、骨生長(zhǎng)等的調(diào)節(jié)起到非常重要的作用。
　　20世紀(jì)70-80年代，競(jìng)爭(zhēng)性蛋白質(zhì)結(jié)合分析法和放射性免疫分析法是檢測(cè)cGMP的主要方式。但由于放射性免疫分析法對(duì)人體有潛在危害，目前已逐步被以兔多抗或鼠單克隆抗體為關(guān)鍵試劑的酶標(biāo)記法和熒光ELISA法取代。多克隆抗體制備的ELISA試劑盒具有批次間差異大和特異性差的問(wèn)題，鼠單克隆抗體制備的ELISA試劑盒無(wú)上述缺點(diǎn)，但不同cGMP濃度間的吸光度值相差非常小，使用者難以得到可重復(fù)性的檢

3、測(cè)數(shù)據(jù)。
　　本研究采用SMCC等偶聯(lián)劑將cGMP偶聯(lián)于載體匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)，形成結(jié)合抗原cGMP-KLH。通過(guò)ELISA方法進(jìn)行偶聯(lián)鑒定，確認(rèn)cGMP已經(jīng)連接到載體蛋白上。用cGMP-KLH作為免疫原免疫新西蘭白兔。將兔子脾細(xì)胞與240E骨髓瘤樣細(xì)胞株融合，得到能夠分泌cGMP抗體的雜交瘤細(xì)胞株。通過(guò)間接ELISA和間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法，選取特異性最好的克隆進(jìn)行亞克隆并擴(kuò)大培養(yǎng)，收集上清并采用ProteinA親和柱純化。

4、
　　采用OD280以及fortebio兩種方法測(cè)定純化后的兔單抗IgG濃度。分別采用直接ELISA和競(jìng)爭(zhēng)ELISA法測(cè)定抗cGMP兔單抗的效價(jià)和特異性。通過(guò)檢測(cè)抗cGMP兔單抗與載體蛋白(BSA、KLH)的反應(yīng)，顯示cGMP兔單抗不識(shí)別載體蛋白。所制備的cGMP兔單抗的效價(jià)為3.1 ng/mL，50％抑制濃度(IC50)為12.57ng/mL。檢測(cè)抗cGMP兔單抗與cAMP、環(huán)磷酸肌苷(cIMP)、環(huán)單磷酸胞苷(cCMP)、單磷

5、酸腺苷(AMP)、腺苷-5'-二磷酸(ADP)、5'-三磷酸腺苷(ATP)、鳥(niǎo)苷-5'-單磷酸(GMP)、5'-鳥(niǎo)苷二磷酸(GDP)、5'-三磷酸鳥(niǎo)苷(GTP)的交叉反應(yīng)性，根據(jù)交叉反應(yīng)率(Cross reaction，CR)判定cGMP兔單抗對(duì)cIMP有33.1％交叉反應(yīng)性，與其他結(jié)構(gòu)類似物交叉反應(yīng)率均小于1.2％。說(shuō)明cGMP兔單抗具有很高的特異性。
　　對(duì)相關(guān)條件進(jìn)行優(yōu)化，得到競(jìng)爭(zhēng)ELISA最佳反應(yīng)條件為:cGMP兔單抗最佳