基于量子點(diǎn)技術(shù)同步檢測(cè)輸血傳染病病原體抗原的方法建立.pdf

1、目的與意義： 在獻(xiàn)血及輸血治療的過程中， HBV、HCV、HIV-1/2以及TP的檢測(cè)是國(guó)家強(qiáng)制性檢測(cè)項(xiàng)目，HBV與HCV是造成輸血后肝炎的主要病原體。目前對(duì)上述多種病原微生物的實(shí)驗(yàn)室診斷方法較多，但各有不足。如ELISA無法同步檢測(cè)多項(xiàng)指標(biāo)、時(shí)間較長(zhǎng)，金標(biāo)法靈敏度較低，PCR和化學(xué)發(fā)光法需借助特殊設(shè)備，對(duì)實(shí)驗(yàn)室要求較高等。 為解決輸血性傳染病的多種病原體的抗原同步檢測(cè)，本研究擬以乙肝表面抗原和丙肝核心抗原的同步檢測(cè)為例

2、，建立一種高靈敏度和特異性、穩(wěn)定性好的抗原同步快速檢測(cè)體系。將量子點(diǎn)技術(shù)與磁微粒技術(shù)相結(jié)合，以磁微粒富集以提高靈敏度，利用不同量子點(diǎn)在相同波長(zhǎng)激發(fā)光下發(fā)射不同熒光的特性達(dá)到同步檢測(cè)的目的。為建立針對(duì)多種輸血傳染病病原體抗原的同步檢測(cè)液相芯片奠定基礎(chǔ)。 材料與方法： 1.磁微粒的活化及其與抗體的連接：選擇粒徑3μm的羧基化磁微粒，采用碳二亞胺共價(jià)交聯(lián)法，在活化劑EDC與NHS的不同濃度組合條件下活化磁微粒，選擇最適的活化劑

3、濃度組合。以不同濃度的鼠抗HBsAg-IgG、鼠抗HCcAg-IgG連接磁微粒，在不同反應(yīng)時(shí)間、pH值的條件組合下考察抗體與磁微粒的連接效果，以Folin-酚法評(píng)價(jià)抗體連接效率。 2.量子點(diǎn)的活化及其與抗體的連接：采用碳二亞胺共價(jià)交聯(lián)法以EDC及NHS活化發(fā)射波長(zhǎng)為581nm、618nm的羧基化CdSe量子點(diǎn)，以不同濃度的兔抗HBsAg-IgG、兔抗HCcAg-IgG連接量子點(diǎn)并在不同反應(yīng)時(shí)間、pH值的條件組合下考察抗體與磁微粒

4、的連接效果，以Folin-酚法評(píng)價(jià)抗體連接效率。 3.單指標(biāo)檢測(cè)的體系建立：以連接抗體的量子點(diǎn)作為熒光標(biāo)記物，以連接抗體的磁微粒為載體作固-液分離，確定最適標(biāo)本檢測(cè)時(shí)間。作陰性血清檢測(cè)以檢測(cè)熒光強(qiáng)度并以2倍陰性對(duì)照均值+空白對(duì)照均值作為單指標(biāo)檢測(cè)Cut off值判讀結(jié)果。對(duì)不同濃度的HBsAg、HCcAg抗原標(biāo)準(zhǔn)品作單指標(biāo)檢測(cè)以確定檢測(cè)范圍。并作重復(fù)性實(shí)驗(yàn)和準(zhǔn)確度評(píng)價(jià)。 4.同步檢測(cè)HBsAg和HCcAg體系的建立：在單

5、指標(biāo)檢測(cè)的基礎(chǔ)上整合反應(yīng)條件及最適標(biāo)本檢測(cè)時(shí)間，作陰性血清檢測(cè)以檢測(cè)熒光強(qiáng)度并以2倍陰性對(duì)照均值+空白對(duì)照均值作為單指標(biāo)檢測(cè)Cut o.ff值判讀結(jié)果。混合激發(fā)光的記錄以濾光片濾去一種顏色光線后記錄一項(xiàng)結(jié)果，更換濾光片后記錄另一結(jié)果。 5.對(duì)不同濃度HBsAg、HCcAg抗原標(biāo)準(zhǔn)品混合物作同步檢測(cè)以確定檢測(cè)范圍。 6.對(duì)188例臨床標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，并與ELISA試劑盒檢測(cè)結(jié)果相比較。 7.選取10ng/mL、100

6、ng/mL、1μg/mL三個(gè)濃度抗原標(biāo)準(zhǔn)品作同步檢測(cè)的批內(nèi)、天間重復(fù)性實(shí)驗(yàn)。 8.以脂血、溶血、黃疸標(biāo)本作干擾實(shí)驗(yàn)。以HAV、TP抗體陽性標(biāo)本作特異性實(shí)驗(yàn)。 9.將準(zhǔn)備好的試劑及反應(yīng)后的復(fù)合物于4℃保存一定時(shí)間后觀察保存時(shí)間對(duì)檢測(cè)效果的影響。 主要結(jié)果： 1.磁微粒的選擇及連接抗體的條件選擇：鼠抗HBsAg-IgG連接磁微粒的活化劑濃度為EDC6mg/L、NHS4mg/L，連接時(shí)間120min，最適pH值

7、6.6，最適濃度20mg/mL，連接效率41％，并制備試劑1(RIHBV)。 鼠抗HCcAg-IgG連接磁微粒的活化劑濃度為EDC4mg/L、NHS4mg/L，連接時(shí)間120min，最適pH值6.6，最適濃度20mg/mL，連接效率44％，并制備試劑2(R2HBV)。 上述RIHBV、RIHCV清洗后加入l％BSA封閉磁微粒表面剩余位點(diǎn)過夜。 2.量子點(diǎn)連接抗體的條件選擇：兔抗HBsAg-IgG連接581nm量子

8、點(diǎn)，連接時(shí)間120min，最適pH值6.2，最適濃度20mg/mL，連接效率45％，并制備試劑1(R1HCV)。 兔抗HBsAg-IgG連接581nm量子點(diǎn)，連接時(shí)間120min，最適pH值6.2，最適濃度10mg/mL，連接效率45％，并制備試劑2(R2HCV)。 3.量子點(diǎn)磁微粒單指標(biāo)檢測(cè)體系：于EP管內(nèi)同時(shí)加入標(biāo)本50μL，Rl各100μL，R2各5μL，反應(yīng)體系pH值7.4，計(jì)算Cut off值為122和136(

9、HBsAb與HCcAg)，檢測(cè)范圍為2ng/mL-10μg/mL、5ng/mL-5μg/mL。檢測(cè)時(shí)間分別縮短到30min、40min。 4.量子點(diǎn)磁微粒體系單項(xiàng)檢測(cè)HBsAg和HCcAg標(biāo)準(zhǔn)品，批內(nèi)重復(fù)性實(shí)驗(yàn)平均CV值為9.7％、9.8％；天間重復(fù)性實(shí)驗(yàn)平均CV值為10.3％、10.1％。 5.量子點(diǎn)磁微粒同步檢測(cè)體系：于EP管內(nèi)同時(shí)加入標(biāo)本5100μL，R1各100μL，R2各5μL，反應(yīng)體系pH值7.4，計(jì)算Cut

10、 off值為133/140，檢測(cè)范圍為2ng/mL-10μg/mL，5ng/mL-5μg/mL。檢測(cè)時(shí)間從th/3h同步縮短到40min。 6.對(duì)188份臨床標(biāo)本的同步檢測(cè)結(jié)果，HBsAg陽性：PCR方法36例，量子點(diǎn)-磁微粒法35例，ELISA方法34例。HCcAg陽性：PCR方法11例，量子點(diǎn).磁微粒法11例， ELISA方法8例。對(duì)2例HBV與HCV混合感染的臨床標(biāo)本及5例標(biāo)準(zhǔn)品混合樣本成功檢出。HBsAg檢測(cè)結(jié)果與PCR

11、方法比較，符合率98.4％，靈敏度94.4％，特異度99.3％； HCcAg檢測(cè)結(jié)果與ELISA方法比較符合率97.9％，靈敏度81.8％，特異度98.9％。 7.同步檢測(cè)HBsAg和HCcAg標(biāo)準(zhǔn)品，批內(nèi)重復(fù)性實(shí)驗(yàn)平均CV值為10.0％、10.1％；天間重復(fù)性實(shí)驗(yàn)平均CV值為10.7％、10.6％。 8.檢測(cè)肉眼可見的溶血、黃疸、脂血標(biāo)本，對(duì)結(jié)果無干擾。與其它常見致輸血后感染的病原體(TP、HAV)無交叉反應(yīng)。

12、 9.試劑R1、R2于4℃保存4周后使用，與新配置試劑檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品結(jié)果無顯著差異。結(jié)合目標(biāo)抗原后的復(fù)合物標(biāo)本，經(jīng)4℃放置4周后熒光強(qiáng)度無明顯衰減。最長(zhǎng)放置8周后仍可檢出熒光。 結(jié)論： 1.本研究利用不同量子點(diǎn)在相同激發(fā)光照射下可發(fā)射不同顏色熒光的特性，選用輸血傳染病中造成輸血后肝炎的兩種主要病原體HBV和HCV的抗原檢測(cè)為例，成功達(dá)到了同步檢測(cè)不同抗原的目的，為建立針對(duì)多種輸血傳染病病原體抗原的檢測(cè)體系建立奠定了基礎(chǔ)。同時(shí)

13、由于針對(duì)抗原作檢測(cè)，相對(duì)抗體檢測(cè)較大幅度提前了陽性檢出時(shí)間，避免了因抗體形成的窗口期造成的漏檢。 2.以碳二亞胺法連接了不同源的抗體于羧基化磁微粒和量子點(diǎn)表面，以雙抗體夾心法檢測(cè)抗原，由于采用磁微粒作為固相載體，在不借助大型特殊設(shè)備的條件下獲得了較高的靈敏度，對(duì)HBsAg與HCcAg檢測(cè)靈敏度分別為2ng/mL、5ng/mL。 3.對(duì)臨床標(biāo)本的檢測(cè)結(jié)果與ELISA試劑比較無顯著性差異，但檢測(cè)時(shí)間明顯縮短，對(duì)HBsAg與H