抗黑條矮縮病轉(zhuǎn)基因水稻新品系的鑒定和感病植株轉(zhuǎn)錄組分析.pdf

1、水稻黑條矮縮病是由水稻黑條矮縮病病毒(rice black-streaked dwarf virus，RBSDV)引起的威脅南方水稻生產(chǎn)的一種重要的病害，該病毒是通過寄主灰飛虱在多種農(nóng)作物上進(jìn)行傳播。水稻黑條矮縮病不僅在各水稻種植國造成嚴(yán)重的減產(chǎn)，同時也影響其他農(nóng)作物，比如大麥、玉米。感染上該病害的水稻植株通常明顯矮縮，葉色濃綠，在葉脈上也會有瘤狀突起。水稻黑條矮縮病病毒(RBSDV)屬于呼腸孤病毒科（Reoviridae）斐濟(jì)病毒屬（

2、Fijivirus），病毒的基因組由10條雙鏈RNA(dsRNA)組成。本實驗室已經(jīng)將水稻黑條矮縮病毒的S7-1和S8基因的RNAi結(jié)構(gòu)導(dǎo)入粳稻品種抗條武育粳3號中，本研究是從其后代篩選無選擇標(biāo)記基因的抗水稻黑條矮縮病新品系，并研究感染黑條矮縮病水稻的轉(zhuǎn)錄組特征:
　　1、無選擇標(biāo)記轉(zhuǎn)基因純系水稻的篩選和目的基因聚合:利用PCR技術(shù)進(jìn)行目的基因和標(biāo)記基因的篩選。經(jīng)過5代的篩選，從19個轉(zhuǎn)S7-RNAi水稻轉(zhuǎn)化子中，篩選到了11個無

3、選擇標(biāo)記的純合轉(zhuǎn)化子，去標(biāo)記頻率為57.89％;同時在16個轉(zhuǎn)S8-RNAi水稻轉(zhuǎn)化子中，得到了9個無選擇標(biāo)記的純合轉(zhuǎn)化子，去標(biāo)記頻率為56.25％;
　　2、自然抗性鑒定:無選擇標(biāo)記基因轉(zhuǎn)基因水稻植株為自然抗性鑒定對象，其轉(zhuǎn)化受體抗條武育粳三號為親本對照。自然鑒定結(jié)果顯示在500株親本中共發(fā)現(xiàn)了18株疑似病株，通過RT-PCR方法對疑似病株進(jìn)行鑒定，均確認(rèn)帶有黑條矮縮病病毒，其發(fā)病率為3.6％。而在1200株轉(zhuǎn)S7-RNAi和1

4、000株轉(zhuǎn)S8-RNAi轉(zhuǎn)基因水稻植株中，則未發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)感病情況的水稻植株。自然鑒定結(jié)果初步說明了轉(zhuǎn)基因水稻的抗水稻黑條矮縮病的能力要明顯高于其受體轉(zhuǎn)化親本。
　　3、農(nóng)藝性狀調(diào)查:選取了來源于不同轉(zhuǎn)化子的10個轉(zhuǎn)S7-RNAi水稻株系和10個轉(zhuǎn)S8-RNAi水稻株系進(jìn)行農(nóng)藝性狀調(diào)查。對所選取的水稻株系進(jìn)行株高，有效分蘗數(shù)，主穗長，結(jié)實率，千粒重的調(diào)查。統(tǒng)計分析結(jié)果表明導(dǎo)入的外源基因?qū)Υ蟛糠种晗禌]有顯著影響。
　　4、感病植株

5、的轉(zhuǎn)錄組分析:以自然鑒定中發(fā)現(xiàn)的3株病株和其對應(yīng)的親本植株為材料，基于Illumina二代測序平臺的RNA-seq技術(shù)，成功獲得2個親本對照植株和3個感病植株的轉(zhuǎn)錄本序列信息。測序結(jié)果顯示在親本1和親本2中分別檢測到了26482和31150個表達(dá)基因，同時有23692，28363和31853個基因分別在病葉1，病葉2-1和病葉2-2中表達(dá)。并依照差異基因表達(dá)變化2倍以上(fold change＞=2)且Pvalue＜=0.05對兩組實驗