人胚胎干細胞來源CD34+細胞與臍血來源CD34+細胞EMT相關(guān)分子表達的比較.pdf

1、造血干細胞移植(hematopoietic stem cell transplantation，HSCT)是治療許多血液系統(tǒng)疾病的重要手段，目前常用的移植供源包括骨髓，外周血和臍血。但是，移植技術(shù)的開展受到供源不足和配型成功率低的限制。因此，開發(fā)新的移植供源具有重要意義。胚胎干細胞可能滿足這項需求。臨床上移植開展常將CD34抗原作造血干細胞的標記，體外研究表明通過誘導(dǎo)自發(fā)分化，或者與S17，OP9等基質(zhì)細胞共培養(yǎng)的方法已經(jīng)能夠?qū)⑴咛ジ杉?/p>

2、胞分化為CD34+細胞。但是體內(nèi)實驗表明，這些分化的CD34+細胞并不能完全模擬臍血等移植供源的功能。臍血因其具有相對容易獲得性，低的感染率和低的移植物抗宿主反應(yīng)被應(yīng)用到移植上。那么研究胚胎干細胞來源的CD34+細胞與臍血來源的CD34+細胞的差異對于了解胚胎干細胞分化機制非常重要。體內(nèi)研究表明，在胚胎發(fā)育過程中，造血干細胞主要由中胚層發(fā)育而來，產(chǎn)生造血干細胞的主要場所是主動脈-性腺-中腎區(qū)(aorta-gonad-mesonephro

3、s，AGM)和胎肝(fetal liver，F(xiàn)L)。在胎肝產(chǎn)生造血干細胞過程中，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymaltransition，EMT)機制起到了重要的作用。在體外研究中，關(guān)于EMT機制在胚胎干細胞向CD34+細胞分化中作用尚無定論。因此，探討EMT機制在胚胎干細胞向CD34+分化過程的作用將會有一定的價值。已有研究表明，在胚胎干細胞分化的過程中干細胞標記會減少或消失，這些標記的減少或消失是否也與CD34

4、有關(guān)聯(lián)呢？在此假設(shè)的基礎(chǔ)上，我們研究了胚胎干細胞向CD34+細胞分化過程中具有代表性的干細胞標記NANOG;和EMT相關(guān)的重要的鈣粘蛋白E-cadherin和N-cadherin;EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Snail1，Snail2，Zeb1，Zeb2的表達變化，并比較了純化后的胚胎干細胞來源和臍血來源的CD34+細胞以上分子的表達變化。研究發(fā)現(xiàn)
　　1.胚胎干細胞分化為CD34+細胞過程中NANOG的表達水平逐漸降低;純化后的胚胎干細胞

5、來源的CD34+（human embryonic stem cell-derived CD34+，hESCs-CD34+）細胞的NANOG水平高于純化后臍血來源CD34+(umbilical cord blood-derived CD34+，UCB-CD34+)細胞。即隨著胚胎干細胞向CD34+細胞分化，hESCs-CD34+細胞NANOG表達逐漸下降，但仍然高于UCB-CD34+細胞。
　　2.胚胎干細胞分化為CD34+細胞過程

6、中，EMT相關(guān)上皮性鈣粘蛋白E-cadherin表達逐漸下降;間質(zhì)性鈣粘蛋白N-cadherin逐漸上升;EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因Snail1，Snail2，Zeb1，Zeb2表達水平逐漸上升。純化后hESCs-CD34+細胞E-cadherin的表達高于純化后UCB-CD34+細胞;N-cadherin的表達低于純化后UCB-CD34+細胞;轉(zhuǎn)錄因子Snail1，Snail2，Zeb1，Zeb2的表達低于純化后UCB-CD34+細胞。即隨著胚

7、胎干細胞向CD34+細胞分化，hESCs-CD34+細胞E-cadherin表達逐漸下降，但仍然高于UCB-CD34+細胞;N-cadherin和轉(zhuǎn)錄因子Snail1，Snail2，Zeb1，Zeb2表達逐漸上升，但仍低于UCB-CD34+細胞。
　　第一部分人胚胎干細胞培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化為CD34+細胞
　　目的: 研究人胚胎干細胞的培養(yǎng)方法以及用不同方法將hESC-H9誘導(dǎo)分化為CD34+細胞
　　方法: 以小鼠胚胎成

8、纖維細胞(mouse embryonic fibroblast，MEF)作為滋養(yǎng)層，將人胚胎干細胞細胞系hESC-H9進行二維培養(yǎng)，對培養(yǎng)細胞進行干性標記時相專一性抗原(stage specific embryonicant，SSEA) SSEA-4，腫瘤識別抗原(tumor rejectionantigen，Tra)Tra-1-81以及堿性磷酸酶染色檢測;利用胚胎干細胞誘導(dǎo)自發(fā)分化和與基質(zhì)細胞OP9共培養(yǎng)誘導(dǎo)分化的方法得到CD34+細

9、胞;對誘導(dǎo)過程中不同時間點CD34變化進行流式分析和Real-time PCR檢測。
　　結(jié)果: hESC-H9表達干細胞標記SSEA-4及Tra-1-81，堿性磷酸酶染色陽性;以自發(fā)分化和OP9誘導(dǎo)分化的方法可以得到CD34+細胞，CD34+細胞比例在培養(yǎng)第8天至第10天為3％-5％，達到最大值;用流式細胞儀檢測，OP9誘導(dǎo)分化方法得到的CD34+細胞分群更為明顯，Real-time PCR檢測證實CD34+細胞變化趨勢。

10、r>　　第二部分人胚胎干細胞來源CD34+細胞和臍血來源CD34+細胞NANOG表達比較
　　目的: 研究hESC-H9誘導(dǎo)分化為CD34+細胞過程中不同時間點、hESCs-CD34+細胞與UCB-CD34+細胞干細胞標記NANOG的表達比較
　　方法: 在hESC-H9誘導(dǎo)分化為CD34+細胞過程中，收集分化不同時間點的細胞，比較NANOG的變化;hESC-H9誘導(dǎo)分化為CD34+細胞D8收集hESCs-CD34+細胞，用

11、流式細胞儀分選純化后hESCs-CD34+細胞;從臨床收集臍血標本，用磁珠分選的方法獲得純化后UCB-CD34+細胞，比較兩者來源CD34+細胞中NANOG的表達差異。
　　結(jié)果: 在hESC-H9誘導(dǎo)分化CD34+細胞過程中，NANOG的表達量逐漸下降;純化后hESCs-CD34+細胞的NANOG的表達較UCB-CD34+細胞高。
　　第三部分人胚胎干細胞來源CD34+細胞分選和臍血來源CD34+細胞EMT相關(guān)分子表達比較

12、
　　目的: 研究hESC-H9誘導(dǎo)分化為CD34+細胞過程中不同時間點、hESCs-CD34+細胞與UCB-CD34+細胞EMT相關(guān)分子的表達比較
　　方法: 在hESC-H9誘導(dǎo)分化為CD34+細胞過程中，收集分化不同時間點的細胞，比較EMT相關(guān)分子E-cadherin、N-cadherin、Snail1、Snail2、Zeb1和Zeb2的表達變化;hESC-H9誘導(dǎo)分化后D8收集hESCs-CD34+細胞，用流式細胞儀

13、分選純化后hESCs-CD34+細胞;從臨床收集臍血標本，用磁珠分選的方法獲得純化后UCB-CD34+細胞，比較兩者來源CD34+細胞EMT相關(guān)分子E-cadherin、N-cadherin、Snail1、Snail2、Zeb1和Zeb2的表達差異。
　　結(jié)果: 在hESC-H9誘導(dǎo)分化CD34+細胞過程中，隨著分化時間的延長，上皮性標記E-cadherin的表達量逐漸下降;間質(zhì)性標記N-cadherin逐漸上升;EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因

14、子Snail1、Snail2、Zeb1、Zeb2的表達量逐漸上升;純化后hESCs-CD34+細胞的E-cadherin的表達水平較UCB-CD34+細胞高，N-cadherin及轉(zhuǎn)錄因子Snail1、Snail2、Zeb1、Zeb2的表達水平較UCB-CD34+細胞低。
　　綜上所述，首先，本研究鑒定了hESC-H9的干細胞特性。其次，通過誘導(dǎo)自發(fā)分化和與OP9共培養(yǎng)的方法能夠誘導(dǎo)hESC-H9分化為CD34+細胞。結(jié)果證實，在

15、誘導(dǎo)分化的過程中，CD34的表達逐漸增高;干細胞標記NANOG的表達逐漸下降;與EMT相關(guān)的上皮性標記表達逐漸下降，間質(zhì)性標記表達逐漸上升，轉(zhuǎn)錄因子的表達也逐漸上升。最后，比較純化后hESCs-CD34+細胞和UCB-CD34+細胞，我們發(fā)現(xiàn)純化后hESCs-CD34+細胞的干細胞標記NANOG，EMT相關(guān)上皮性標記E-cadherin，比UCB-CD34+細胞高，但是間質(zhì)性標記及轉(zhuǎn)錄因子比UCB-CD34+細胞低，提示胚胎干細胞誘導(dǎo)分