臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合臍血干細(xì)胞治療Ⅰ型糖尿病的初步研究.pdf

1、目的：建立一種簡(jiǎn)便、高效臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞分離方法。 方法：臍帶組織剔除血管后，余下的組織用不同酶混合液消化，消化后的細(xì)胞懸液培養(yǎng)在含10ng/mlbFGF和10％FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基中，粘附層細(xì)胞用胰酶消化傳代培養(yǎng)。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)及免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)細(xì)胞的免疫表型，在標(biāo)準(zhǔn)的成骨成脂誘導(dǎo)分化條件下檢測(cè)細(xì)胞的分化潛能。 結(jié)果：臍帶組織應(yīng)用中性蛋白酶、膠原酶Ⅰ和透明質(zhì)酸酶混合液消化后，每5cm長(zhǎng)度的臍帶可分離1×1

2、06單個(gè)核細(xì)胞，培養(yǎng)10天后可得2.2×106細(xì)胞。傳代培養(yǎng)后，細(xì)胞為均一的成纖維樣長(zhǎng)梭形。應(yīng)用此種方法在分離難度、細(xì)胞得率等方面明顯優(yōu)于其它酶或酶混合液消化方法。分離培養(yǎng)后的細(xì)胞，倍增時(shí)間為（34±4）h，表達(dá)與骨髓間質(zhì)細(xì)胞一致的表面標(biāo)志（CD29、CD90、vimentin、SMA、desmin），不表達(dá)造血和內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志（CD34、CD45、CD31、KDR），并表達(dá)多能干細(xì)胞標(biāo)志（SSEA4、OCT-4），同時(shí)具有向成骨、成脂細(xì)

3、胞分化的能力。 結(jié)論：應(yīng)用三種酶的混合液消化間質(zhì)組織分離臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，操作簡(jiǎn)便，分離過(guò)程中，保持了細(xì)胞活力，細(xì)胞產(chǎn)量高，可以為臨床應(yīng)用提供大量高質(zhì)量種子細(xì)胞。 目的：探討臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞能否在體外向胰島素分泌細(xì)胞分化。 方法：用含β-巰基乙醇、表皮生長(zhǎng)因子、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、B27及尼克酰胺的高糖DMEM培養(yǎng)基誘導(dǎo)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞向胰島素分泌細(xì)胞分化。相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化；誘導(dǎo)階段采用流式術(shù)檢測(cè)

4、PDX-1的表達(dá)；誘導(dǎo)后采用免疫化學(xué)染色檢測(cè)胰島素和C肽的表達(dá)：化學(xué)發(fā)光法測(cè)定低糖/高糖刺激下胰島素的分泌情況；RT-PCR檢測(cè)胰腺相關(guān)基因的表達(dá)，如Ngn3、insulin、glucagon和somatostatin的表達(dá)。 結(jié)果：誘導(dǎo)后細(xì)胞形態(tài)由長(zhǎng)梭形逐漸變圓而且聚集成團(tuán)，誘導(dǎo)第二階段表達(dá)PDX-1，誘導(dǎo)第三階段后細(xì)胞免疫化學(xué)染色表達(dá)胰島素和C肽，誘導(dǎo)組細(xì)胞經(jīng)高糖刺激后釋放胰島素，RT-PCR可檢測(cè)到insulin、Gluc

5、agon、Somatostatin、ngn3等胰島相關(guān)基因。 結(jié)論：人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在特定的條件下可誘導(dǎo)分化為具有分泌胰島素功能的胰島樣細(xì)胞。 目的：觀察hUCMSCs聯(lián)合臍血干細(xì)胞在Ⅰ型糖尿病治療中的作用。 方法：連續(xù)小劑量腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ）給C57/BL6雄鼠，觀察血糖濃度與糖耐量水平，建立Ⅰ型糖尿病小鼠模型。建模后，將hUCMSCs與臍血干細(xì)胞按不同比例，細(xì)胞總數(shù)量2×106細(xì)胞，通過(guò)尾靜脈移植

6、給受亞致死劑量（300cGy）照射后小鼠，觀察血糖變化。移植后28天，胰腺組織切片行人源胰島素免疫化學(xué)染色檢測(cè)植入細(xì)胞是否分化為胰島素分泌細(xì)胞，HE染色和小鼠胰島素免疫化學(xué)染色檢測(cè)受損的胰島是否得到修復(fù)。為了解植入細(xì)胞在組織中的定位，免疫化學(xué)染色法檢測(cè)腎臟及胰腺組織切片中的人核抗原，抽提腎臟及胰腺DNA經(jīng)PCR方法檢測(cè)人特異性Alu基因。 結(jié)果：注射STZ后7天，兩次隨機(jī)血糖大于16mmol/L的小鼠為Ⅰ型糖尿病小鼠。將hUCM

7、SCs與臍血干細(xì)胞按1：4比例移植入糖尿病小鼠體內(nèi)，能明顯地改善胰島的結(jié)構(gòu)和功能，小鼠血糖水平明顯降低，胰島素分泌細(xì)胞的數(shù)量增加。然而在移植小鼠的胰腺?zèng)]有檢測(cè)到人胰島素分泌細(xì)胞和人核抗原。進(jìn)一步，通過(guò)檢測(cè)人特異性Alu基因，分析了移植小鼠胰腺和腎臟組織中是否存在移植細(xì)胞。結(jié)果顯示，在部分移植小鼠體內(nèi)存在人特異性Alu基因DNA，提示移植細(xì)胞在糖尿病小鼠胰腺和腎臟組織中存在。 結(jié)論：hUCMSCs聯(lián)合臍血干細(xì)胞移植后可定位于Ⅰ型糖