體外誘導(dǎo)分化的人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞治療脊髓損傷的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、本文研究目的：探討人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)體外分離培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細(xì)胞的條件；觀察誘導(dǎo)后的MSCs源性神經(jīng)細(xì)胞移植對(duì)大鼠脊髓損傷的治療效果，為治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷提供實(shí)用的細(xì)胞來(lái)源。 研究方法： 1．體外分離、純化、擴(kuò)增臍血MSCs：采用Ficoll分離法分離臍血單個(gè)核細(xì)胞(mononuclear cells，MNCs)，并以低糖DMEM(含10％FBS)培養(yǎng)基接種

2、于6孔培養(yǎng)板中，胰酶消化傳代。取傳三代的細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面分子CD11b、CD34、CD45和CD44的表達(dá)。 2．臍血MSCs的誘導(dǎo)分化：采用腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子BDNF 10ng/ml+維甲酸RA 0.5μM+堿性成纖維生長(zhǎng)因子bFGF 20ng/ml協(xié)同誘導(dǎo)培養(yǎng)三代的臍血MSCs定向分化。誘導(dǎo)7d后，用免疫熒光染色法檢測(cè)星形膠質(zhì)細(xì)胞特異標(biāo)志GFAP及神經(jīng)元特異標(biāo)志MAP2的表達(dá)情況。 3．體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：采用橫

3、切法制備大鼠脊髓橫斷損傷模型，實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為三組：PBS組、細(xì)胞移植組、單純手術(shù)組，每組10只。損傷術(shù)后48h，分別于損傷部位注入等量的PBS、Brdu標(biāo)記的誘導(dǎo)后的細(xì)胞，單純手術(shù)組損傷后不施加任何干預(yù)作為對(duì)照。采用BBB運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)在移植術(shù)后24h及1、2、3、4、5w各時(shí)間點(diǎn)對(duì)大鼠進(jìn)行運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分。用組織學(xué)和免疫組化方法檢測(cè)移植到大鼠脊髓中的Brdu陽(yáng)性細(xì)胞的存活、遷移情況。 研究結(jié)果：臍血MSCs體外培養(yǎng)三代后，細(xì)胞

4、表面CD11b、CD34、CD45、CD44表達(dá)陰性。誘導(dǎo)分化7d后，大部分細(xì)胞的形態(tài)類似神經(jīng)元，免疫熒光染色檢測(cè)MAP2陽(yáng)性細(xì)胞占大多數(shù)，明顯多于GFAP陽(yáng)性細(xì)胞。移植后2～5w，細(xì)胞移植組大鼠的后肢運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)情況均好于PBS組和單純手術(shù)組(P<0.05)。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示植入的細(xì)胞可長(zhǎng)時(shí)間在宿主脊髓中存活，并向損傷處兩端遷移。 研究結(jié)論：人臍血MSCs于體外在特定的條件下可以誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞為主體的神經(jīng)細(xì)胞。移植