應(yīng)用雙砷熒光標(biāo)記法觀察乙肝病毒核心蛋白細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、乙型肝炎病毒（Hepatitis B Virus，HBV）感染嚴(yán)重危害人類健康，它是當(dāng)今世界上引起急性肝功能衰竭、慢性活動(dòng)性肝炎、肝硬化甚至肝癌等肝臟疾病的重要原因之一。乙肝病毒在分類上歸屬于嗜肝DNA病毒家族，其核心蛋白（HBV core protein，HBc），不僅構(gòu)成病毒的蛋白質(zhì)衣殼，同時(shí)也是診斷HBV感染的重要血清學(xué)標(biāo)志。在HBV感染過(guò)程中，HBc發(fā)揮著多種生物學(xué)功能，除了包裝病毒前基因組RNA與聚合酶蛋白形成核衣殼外，它還參

2、與調(diào)節(jié)病毒DNA的復(fù)制，病毒顆粒的成熟，核衣殼與包膜蛋白的識(shí)別及病毒分泌等過(guò)程。盡管研究者們已經(jīng)獲取了較多關(guān)于核心蛋白結(jié)構(gòu)與功能的信息，但是有關(guān)核心蛋白及核心顆粒在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)的研究卻仍有待深入。
　　 【目的】研究半胱氨酸短肽序列Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys 插入HBV核心蛋白主要免疫顯性區(qū)c/e1位點(diǎn)附近后對(duì)病毒核心蛋白表達(dá)及病毒顆粒形成的影響，探討利用雙砷化合物ReAsH標(biāo)記法示蹤核心蛋白在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)的可行

3、性，為運(yùn)用此技術(shù)在活細(xì)胞中觀察HBV病毒顆粒的動(dòng)態(tài)轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 【方法】運(yùn)用PCR及分子克隆技術(shù)，在質(zhì)粒pTHBV1.3的C基因區(qū)引入編碼半胱氨酸短肽的寡核苷酸序列，將所得質(zhì)粒命名pTHBV1.3-TC。應(yīng)用脂質(zhì)體Lipofectamine2000將pTHBV1.3-TC與pTHBV1.3分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染入HepG2細(xì)胞株。轉(zhuǎn)染48 h后，Western Blot，免疫熒光檢測(cè)核心蛋白表達(dá)；透射電鏡觀察HBV病毒顆粒

4、的形成。細(xì)胞轉(zhuǎn)染pTHBV1.3-TC36 h后，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行雙砷ReAsH標(biāo)記，運(yùn)用Olympus FV-500激光掃描共聚焦顯微鏡進(jìn)行熒光淬滅恢復(fù)試驗(yàn)(Fluorescence Recovery After Photobleaching，F(xiàn)RAP)以檢測(cè)核心蛋白在細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)情況。
　　 【結(jié)果】酶切鑒定和DNA測(cè)序表明，編碼TC嵌合型核心蛋白（tetracysteine-tagged HBV core protein，TC-

5、HBc）的HBV表達(dá)載體pTHBV1.3-TC構(gòu)建成功。將質(zhì)粒pTHBV1.3和pTHBV1.3-TC分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，Western Blot檢測(cè)顯示野生型和突變型核心蛋白均有表達(dá)，且兩種蛋白瞬時(shí)表達(dá)的水平?jīng)]有明顯差別（t=0.157，P=0.88）；免疫熒光檢測(cè)進(jìn)一步驗(yàn)證了兩種蛋白的表達(dá)，但野生型核心蛋白（wild type HBV core protein，WT-HBc）與TC嵌合型核心蛋白相比表現(xiàn)為更為明顯的核定位。投射電鏡觀察，

6、在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染了pTHBV1.3-TC的細(xì)胞胞漿漿及培養(yǎng)上清中均發(fā)現(xiàn)40 nm的病毒樣顆粒，且上清中還存在20 nm左右的球形顆粒。FRAP結(jié)果得到TC-HBc在細(xì)胞內(nèi)移動(dòng)分?jǐn)?shù)（mobile fraction，Mf）Mf=66.9%。
　　 【結(jié)論】半胱氨酸短肽標(biāo)簽（tetracysteine tag，TC tag）在插入HBV核心蛋白免疫顯性區(qū)域（MIR）c/e1位點(diǎn)附近后，對(duì)蛋白的表達(dá)及病毒顆粒的組裝無(wú)顯著影響，說(shuō)明TC序列可在