鹽對(duì)慢性腎衰大鼠腎臟磷酸化蛋白質(zhì)組及孤束核RAS的影響.pdf

1、第一部分不同濃度飲食鹽下慢性腎衰大鼠腎臟皮質(zhì)的磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)分析
　　 研究背景：
　　 據(jù)報(bào)道慢性腎衰早期高血壓的發(fā)生率為50％，發(fā)展到終末期有高血壓者為60～100％，而持續(xù)存在的高血壓又會(huì)加速慢性腎臟病的進(jìn)展，形成惡性循環(huán)，因此積極控制血壓在慢性腎衰的各階段治療中都具有重要意義。飲食鹽的增加是促進(jìn)高血壓發(fā)生發(fā)展的最重要的環(huán)境因素，并且飲食鹽的增加還具有獨(dú)立于血壓的作用，如導(dǎo)致左心室肥厚、動(dòng)脈硬化、阻力血管狹窄、腎

2、臟肥大和腎間質(zhì)纖維化等。早在1976年Ylitalo研究小組就發(fā)現(xiàn)了在慢性腎衰的大鼠中存在鹽敏感性。此后Koomans等人發(fā)現(xiàn)慢性腎衰的患者也存在鹽敏感性。雖然關(guān)于慢性腎衰鹽敏感性的研究很多，但在慢性腎衰中飲食鹽是如何升高血壓的機(jī)制并不完全清楚，主要包括:鈉代謝異常，交感神經(jīng)活性增強(qiáng)，內(nèi)皮功能受損(NOS)、壓力感受器受損等，上述的一系列機(jī)制大多與蛋白磷酸化信號(hào)途徑的紊亂有關(guān)。雖然關(guān)于這方面的研究很多，但一般都局限于在特定生理或病理狀態(tài)

3、某一蛋白、某一通路的研究，沒能在整體蛋白質(zhì)水平上研究，不能形成一個(gè)統(tǒng)一的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)來研究慢性腎衰鹽敏感性的機(jī)制。
　　 蛋白質(zhì)組學(xué)是在細(xì)胞的整體蛋白質(zhì)水平上進(jìn)行研究，從蛋白質(zhì)整體活動(dòng)的角度來認(rèn)識(shí)生命活動(dòng)規(guī)律的一門新學(xué)科，包括蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，翻譯后的修飾，蛋白與蛋白相互作用等，由此獲得蛋白質(zhì)水平上的關(guān)于疾病發(fā)生，細(xì)胞代謝等過程的整體而全面的認(rèn)識(shí)。蛋白質(zhì)的翻譯后修飾主要包括磷酸化、S-亞硝基化、乙酰甲基化和糖基化等，而蛋白質(zhì)磷酸化是

4、生物界最普遍，最重要，研究最多的一種蛋白質(zhì)翻譯后修飾(PTMs)蛋白質(zhì)的磷酸化和去磷酸化這一可逆的過程，幾乎調(diào)節(jié)著包括細(xì)胞的增殖、發(fā)育、分化、細(xì)胞骨架調(diào)控、神經(jīng)活動(dòng)、肌肉收縮、新陳代謝及腫瘤發(fā)生等過程內(nèi)的所有生命活動(dòng)。目前有許多人類疾病是由于某些異常的磷酸化修飾所引起，包括腫瘤、糖尿病、免疫性疾病、心血管疾病等。腎臟中含有很多種磷酸化蛋白質(zhì)，磷酸化修飾在調(diào)節(jié)腎臟正常生理功能中有著很重要的意義，但異常的磷酸化修飾會(huì)引起疾病，如WNK的異常

5、磷酸化會(huì)引起高血壓和破壞酸堿及電解質(zhì)的平衡。因而分析蛋白質(zhì)磷酸化修飾在不同生理病理狀態(tài)下的相對(duì)變化，可以進(jìn)一步發(fā)掘與疾病發(fā)生發(fā)展相關(guān)的重要生物標(biāo)記物，為揭示其分子機(jī)理奠定基礎(chǔ)。
　　 雖然蛋白質(zhì)組學(xué)越來越多的用來鑒定組織中新的目標(biāo)蛋白，來揭示其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路機(jī)制，但很少有研究運(yùn)用磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究慢性腎衰大鼠鹽敏感性的機(jī)制。本研究的主要目的是運(yùn)用磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究在慢性腎衰大鼠中給予不同濃度的飲食鹽所引起的差異性表達(dá)的

6、磷酸化蛋白，從而闡明慢性腎衰發(fā)生、發(fā)展及鹽敏感性的機(jī)制。
　　 研究方法：
　　 一、動(dòng)物模型的構(gòu)建與組織樣本的采集
　　 1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼養(yǎng)環(huán)境
　　 雄性Sprague Dawley大鼠（購(gòu)自南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）體重150-180g，在SPF級(jí)環(huán)境實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境（南方醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）飼養(yǎng)，自由進(jìn)水和飲食。
　　 2、大鼠5/6腎切除慢性腎衰模型制備
　　 大鼠體重200g左右

7、行左側(cè)腎臟2/3切，一周后進(jìn)行右側(cè)腎全切（完全保留雙側(cè)的腎上腺），假手術(shù)大鼠只進(jìn)行腎包膜剝離。
　　 3、大鼠在手術(shù)后2、4、6、8、10周分別進(jìn)行眼眶靜脈采血，檢測(cè)大鼠血肌酐、尿素氮水平。
　　 4、實(shí)驗(yàn)分組，不同濃度飲食鹽刺激大鼠2周
　　 在二期手術(shù)完成后的第9周，將慢性腎衰大鼠隨機(jī)分組:
　　 (1) Sham+正常鹽飲食飼料組(0.4％NaCl)(n=6)
　　 (2) CRF+正常鹽飲

8、食飼料組(0.4％NaCl)(n=6)
　　 (3) CRF+高鹽飲食飼料組(4％NaCl)(n=6)
　　 分組后，測(cè)量尾動(dòng)脈血壓(softron BP-98A，Japan)作為基線血壓。第十周開始給予不同濃度的飲食鹽刺激大鼠2周。
　　 5、大鼠血、尿和腎臟組織的留取及處理
　　 1)術(shù)后第12周，測(cè)定大鼠血壓后將大鼠放于代謝籠中，留取24小時(shí)尿。
　　 2)腹腔注射麻醉大鼠:給大鼠腹腔注射3

9、％戊巴比妥鈉麻醉，仰臥位固定于鼠臺(tái)上。
　　 3)開腹，腹主動(dòng)脈采血，采血后迅速打開胸腔，灌胃針從左心室穿刺入主動(dòng)脈，同時(shí)剪開右心耳，4℃預(yù)冷的生理鹽水（含肝素20U/ml）200ml快速?zèng)_洗，可看到腎臟、肝臟、肺皮膚和肌肉等快速變蒼白，右心耳流出液體無色清亮。
　　 4)迅速分離腎臟，放入盛有4℃預(yù)冷的1×PBS(PH7.4)的培養(yǎng)皿中清洗。
　　 5)剔除腎臟的被膜和周邊脂肪，稱重，分離腎臟的皮質(zhì)，包于錫箔紙

10、中，液氮速凍，-80℃保存。
　　 6、血肌酐和血尿素氮檢測(cè)（采用臨床自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)）;24h尿蛋白定量:（采用考馬斯亮藍(lán)-G250法檢測(cè)）。
　　 二、運(yùn)用iTRAQ(isobaric tags for relative and absolute quantitation)技術(shù)對(duì)腎臟皮質(zhì)進(jìn)行磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)分析
　　 1、蛋白提取
　　 每組各取適量組織塊樣品，各組內(nèi)6樣品等量混合，液氮研磨，裂解后

11、取上清液采用BCA法蛋白質(zhì)定量。
　　 2、SDS-PAGE電泳
　　 每組取約20μg蛋白質(zhì)樣品，按照5∶1(v/v)比例加入5X上樣緩沖液進(jìn)行12.5％SDS PAGE電泳。
　　 3、酶解和肽段定量
　　 每組取約300μg蛋白樣品，用UA buffer(8M Urea，150mM TrisHCl pH8.0)對(duì)蛋白烷基化后加入胰蛋白酶酶解，完成后OD280肽段定量。
　　 4、肽段標(biāo)記

12、r>　　 每組取等量肽段（約80ug），按照試劑盒:iTRAQ Reagent-4plex Multiplex Kit(AB SCIEX)說明書進(jìn)行標(biāo)記，重復(fù)標(biāo)記1次。將標(biāo)記后的肽段溶液混合，取1/10體積的混合肽段脫鹽，然后進(jìn)行質(zhì)譜分析。取剩余的9/10體積混合肽段真空凍干，凍干后用于二氧化鈦富集。
　　 5、二氧化鈦富集
　　 標(biāo)記后的混合肽段溶液真空凍干，加入1×DHB buffer復(fù)溶。溶液中加入TiO2bea

13、ds，振蕩40min，離心，移去上清液。將beads轉(zhuǎn)入具塞tip頭中，加入washingbuffer1洗滌三次，加入washing buffer2洗滌三次。加入Elution buffer洗脫，收集磷酸化肽段，真空濃縮，用20μL0.1％FA溶解，取10μL用于質(zhì)譜分析。
　　 6、質(zhì)譜分析
　　 1)毛細(xì)管高效液相色譜
　　 樣品采用納升流速HPLC液相系統(tǒng)Easy nLC1000進(jìn)行分離。
　　 2

14、)質(zhì)譜鑒定
　　 樣品經(jīng)毛細(xì)管高效液相色譜分離后用Q-Exactive質(zhì)譜儀（Thermo Finnigan）進(jìn)行質(zhì)譜分析。
　　 7、數(shù)據(jù)分析
　　 1)質(zhì)譜數(shù)據(jù)
　　 質(zhì)譜分析原始數(shù)據(jù)為RAW文件，用軟件Mascot2.2和ProteomeDiscoverer1.3(Thermo Scientific)進(jìn)行查庫(kù)鑒定及定量分析。
　　 2)數(shù)據(jù)庫(kù)
　　 本次使用數(shù)據(jù)庫(kù):ipi.RAT.v

15、3.87.fasta(發(fā)布日期2011-2-27，蛋白質(zhì)序列39925條)。
　　 3) Mascot搜索
　　 查庫(kù)使用Mascot軟件版本為Mascot2.2。查庫(kù)時(shí)將RAW文件通過ProteomeDiscoverer提交至Mascot服務(wù)器，選擇已經(jīng)建立好的數(shù)據(jù)庫(kù)，然后進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)搜索。
　　 4)定量分析
　　 Proteome Discoverer1.3軟件根據(jù)肽段報(bào)告離子峰強(qiáng)度值進(jìn)行定量分析。肽

16、段定量結(jié)果為參考樣品所在標(biāo)簽的信號(hào)強(qiáng)度值與其他標(biāo)簽的信號(hào)強(qiáng)度值的比值。蛋白質(zhì)定量結(jié)果為鑒定肽段定量結(jié)果的中位數(shù)。最終定量結(jié)果再以各標(biāo)簽比值中位數(shù)進(jìn)行歸一化處理，以消除實(shí)驗(yàn)中人為因素引入的上樣量誤差。
　　 5) Phospho RS Note
　　 質(zhì)譜數(shù)據(jù)由Mascot軟件搜索后，再由Proteome Discoverer1.3軟件對(duì)磷酸化肽段進(jìn)行分析(Phospho RS score，PhosphopRS seque

17、nce probability，PhosphoRSsite probabilities), Phospho RS score大于50分，Phospho RS site probabilities大于75％說明磷酸化修飾的可信度較高。
　　 三、統(tǒng)計(jì)方法
　　 所有數(shù)據(jù)均代表3次以上重復(fù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，所有統(tǒng)計(jì)分析由統(tǒng)計(jì)軟件SPSS13.0完成。兩樣本均數(shù)的比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn);方差齊的多樣本均數(shù)的比較

18、采用One-Way ANOVA，兩兩比較采用LSD法;方差不齊的多個(gè)樣本均數(shù)的比較采用Welch法，兩兩比較采用Dunnett's T3法。p＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1.腎衰大鼠模型的確立
　　 在二步法5/6腎切除術(shù)后的第10周，測(cè)量各組大鼠的體重、血壓并采血測(cè)定肌酐、尿素氮含量、24小時(shí)尿蛋白。在第10周時(shí)，各組大鼠的體重?zé)o明顯變化(p＜0.05)，而CRF組收縮壓、血肌酐和尿素氮

19、、24小時(shí)尿蛋白較Sham組均顯著升高(p＜0.05)。
　　 2.不同濃度飲食鹽對(duì)大鼠血壓、24h尿蛋白和尿鈉的影響在正常飲食鹽中，CRF大鼠的血壓和24h尿蛋白的明顯改變(p＜0.05)。在CRF大鼠中，與正常鹽相比，CRF高鹽組大鼠血壓、尿鈉和24h尿蛋白顯著升高(p＜0.05)。
　　 3.不同濃度飲食鹽對(duì)大鼠腎臟皮質(zhì)總蛋白的影響
　　 3.1總蛋白質(zhì)譜鑒定
　　 運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)iTRAQ技術(shù)對(duì)各

20、組腎臟皮質(zhì)進(jìn)行鑒定，鑒定出蛋白2725種，其中定量的蛋白有2695種。鑒定蛋白的定量比值頻數(shù)分布顯示大部分蛋白質(zhì)Ratio比值(NC/NS，HC/NC)接近1，呈對(duì)稱分布，符合統(tǒng)計(jì)學(xué)規(guī)律。
　　 3.2差異蛋白比值頻數(shù)分布
　　 對(duì)有定量信息的蛋白質(zhì)進(jìn)行比較，并計(jì)算其顯著性指數(shù)。在正常飲食鹽中，與Sham大鼠比較(NC/NS)，CRF大鼠有318種蛋白差異表達(dá)(p＜0.05)，其中有164種蛋白表達(dá)升高，154種蛋白表達(dá)

21、下降;在CRF大鼠中，與正常飲食鹽比較(HC/NC)，高鹽CRF大鼠有310種蛋白差異表達(dá)(p＜0.05)，其中157種蛋白表達(dá)升高，153種蛋白表達(dá)下降。
　　 4.不同濃度飲食鹽對(duì)大鼠腎臟皮質(zhì)磷酸化肽段的影響
　　 4.1磷酸化肽段鑒定
　　 運(yùn)用磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)iTRAQ技術(shù)對(duì)各組腎臟皮質(zhì)進(jìn)行鑒定，鑒定出磷酸化的肽段1911種，有定量信息的磷酸化肽段1810種，對(duì)應(yīng)989種磷酸化蛋白。鑒定磷酸化肽段的定量比

22、值頻數(shù)分布顯示大部分磷酸化肽段Ratio比值(NC/NS，HC/NC)接近1，呈對(duì)稱分布，符合統(tǒng)計(jì)學(xué)規(guī)律。
　　 4.2磷酸化肽段位點(diǎn)的分布
　　 對(duì)1810種有定量信息的磷酸化肽段進(jìn)行磷酸化位點(diǎn)的鑒定，鑒定出2565個(gè)磷酸化位點(diǎn)，一個(gè)位點(diǎn)發(fā)生磷酸化的肽段最多，其次是兩位點(diǎn)發(fā)生磷酸化的肽段(1P1151、2P583、3P59、≥4P17)。
　　 4.3總磷酸化肽段的GO分類
　　 利用在線的Panthe

23、r數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)有定量信息的磷酸化肽相應(yīng)的磷酸化蛋白進(jìn)行功能分類。在質(zhì)譜鑒定出的腎臟皮質(zhì)磷酸化蛋白中，蛋白結(jié)合分子和催化活性分子是最主要的功能蛋白。對(duì)有定量信息的磷酸化肽相應(yīng)的磷酸化蛋白進(jìn)行生物學(xué)過程分類。腎臟皮質(zhì)磷酸化蛋白參與了代謝、生物調(diào)節(jié)、細(xì)胞組成、增殖、分化和凋亡等生物學(xué)過程，其中以代謝最多，其次是生物調(diào)節(jié)、轉(zhuǎn)運(yùn)過程。
　　 4.4飲食鹽對(duì)腎臟皮質(zhì)磷酸化肽段的影響
　　 對(duì)有定量信息的磷酸化肽段進(jìn)行比較，并計(jì)算其顯著

24、性指數(shù)。在正常飲食鹽中，與Sham大鼠比較(NC/NS)，CRF大鼠有197種磷酸化肽段差異表達(dá)(p＜0.05)，其中有113種磷酸化肽段表達(dá)升高，84種磷酸化肽段表達(dá)下降;在CRF大鼠中，與正常飲食鹽比較(HC/NC)，高鹽CRF大鼠有169種磷酸化肽段差異表達(dá)(p＜0.05)，其中78種磷酸化肽段表達(dá)升高，91種磷酸化肽段表達(dá)下降。
　　 4.5差異磷酸化蛋白的GO分類
　　 利用在線的Panther數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)差異磷

25、酸化肽相應(yīng)的磷酸化蛋白進(jìn)行功能分類，忽略未分類的磷酸化蛋白，在正常飲食鹽中，慢性腎衰所引起的差異磷酸化肽對(duì)應(yīng)的磷酸化蛋白的主要功能是結(jié)合蛋白核酸和催化活性(NC/NS);在慢性腎衰大鼠中，高鹽引起的差異磷酸化肽對(duì)應(yīng)的磷酸化蛋白的主要功能也是結(jié)合蛋白核酸和催化活性(HC/NC)。根據(jù)生物學(xué)過程分類，在正常飲食鹽中，慢性腎衰所引起的差異磷酸化肽對(duì)應(yīng)的磷酸化蛋白蛋白參與了代謝、生物調(diào)節(jié)、細(xì)胞組成、增殖、分化和凋亡等生物學(xué)過程，其中以代謝最多，

26、其次是生物調(diào)節(jié)、轉(zhuǎn)運(yùn)過程(NC/NS);在慢性腎衰大鼠中，高鹽引起的差異磷酸化肽對(duì)應(yīng)的磷酸化蛋白也參與了代謝、生物調(diào)節(jié)、細(xì)胞組成、增殖、分化和凋亡等生物學(xué)過程，其中以代謝最多，其次是生物調(diào)節(jié)、轉(zhuǎn)運(yùn)過程(HC/NC)。這些反映了慢性腎衰發(fā)生發(fā)展及鹽敏感性形成是復(fù)雜廣泛的調(diào)節(jié)模式。
　　 4.6差異磷酸化蛋白信號(hào)通路分析
　　 通過DAVID6.7在線分析軟件，對(duì)NC/NS組149種差異磷酸化蛋白和HC/NC組127種差異磷

27、酸化蛋白所涉及到的KEGG信號(hào)通路進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示，NC/NS組31種差異磷酸化蛋白所涉及到多種物質(zhì)代謝、病灶粘連、縫隙連接、MAPK、ErbB、mTOR、VEGF、Notch、NOD-like receptor、Calcium等信號(hào)通路，其功能涉及細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、細(xì)胞通訊和凋亡、藥物代謝、醛固酮調(diào)節(jié)鈉的重吸收等過程。HC/NC組32種差異磷酸化蛋白所涉及到多種物質(zhì)代謝、病灶粘連、粘附連接、mTOR、VEGF、Insulin等信

28、號(hào)通路，其功能涉及細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、細(xì)胞通訊和凋亡、藥物代謝等過程。
　　 4.7差異磷酸化蛋白的相互作用分析
　　 利用String數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)NC/NS，HC/NC兩組差異磷酸化蛋白質(zhì)作了進(jìn)一步分析，在NC/NS差異磷酸化蛋白質(zhì)中，36個(gè)差異磷酸化蛋白質(zhì)被網(wǎng)絡(luò)，這些磷酸化蛋白質(zhì)很可能是慢性腎衰發(fā)生發(fā)展相關(guān)信號(hào)通路中的成員。信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)中連接最多的3個(gè)蛋白分別是Polr2a、Srrm1、Srrm2，說明這3個(gè)磷酸化蛋白為

29、慢性腎衰發(fā)生發(fā)展相關(guān)信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)的中心節(jié)點(diǎn)，它們可能是慢性腎衰發(fā)生發(fā)展相關(guān)信號(hào)通路磷酸化的重要靶點(diǎn)。在HC/NC差異磷酸化蛋白質(zhì)中，24個(gè)差異磷酸化蛋白質(zhì)被網(wǎng)絡(luò)，這些磷酸化蛋白質(zhì)很可能是慢性腎衰鹽敏感性形成的相關(guān)信號(hào)通路中的成員。信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)中連接最多的8個(gè)蛋白分別是Lmna、Des、Tnni3、Mydpc3、Vcl、Myh6、Myh7、Myh11，說明這8個(gè)磷酸化蛋白為慢性腎衰鹽敏感性形成的相關(guān)信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)的中心節(jié)點(diǎn)，它們可能是慢性腎

30、衰鹽敏感性形成的相關(guān)信號(hào)通路磷酸化的重要靶點(diǎn)。
　　 結(jié)論：
　　 1.成功運(yùn)用iTRAQ技術(shù)對(duì)大鼠腎臟皮質(zhì)進(jìn)行了磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)分析，構(gòu)建了慢性腎衰大鼠腎臟皮質(zhì)磷酸化蛋白質(zhì)譜;鑒定出1911種磷酸化肽段，有定量信息的1810種，對(duì)應(yīng)989種磷酸化蛋白;
　　 2.發(fā)現(xiàn)149種差異磷酸化蛋白可能與慢性腎衰發(fā)生發(fā)展有關(guān)及127種差異磷酸化蛋白可能與慢性腎衰鹽敏感性的形成有關(guān);
　　 3.基于鑒定的慢性腎衰發(fā)

31、生發(fā)展及鹽敏感性形成相關(guān)信號(hào)通路的磷酸化蛋白質(zhì)，建立慢性腎衰發(fā)生發(fā)展及鹽敏感性形成相關(guān)信號(hào)通路的磷酸化蛋白質(zhì)的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)。
　　 第二部分鹽攝入對(duì)慢性腎衰大鼠腦內(nèi)孤束核腎素血管緊張素系統(tǒng)的影響
　　 研究背景：
　　 慢性腎臟病的防治已成為世界各國(guó)所面臨的重要公共衛(wèi)生問題之一，而慢性腎衰是慢性腎臟病進(jìn)展至一定時(shí)期時(shí)出現(xiàn)的代謝紊亂和臨床癥狀組成的綜合征。CRF患者大部分有不同程度的高血壓，其發(fā)生率為60％～100％，

32、持續(xù)存在的高血壓又會(huì)加速慢性腎臟病的進(jìn)展，形成惡性循環(huán)，因此積極控制血壓在慢性腎衰的各階段治療中都具有重要意義。眾所周知飲食鹽的增加是促進(jìn)高血壓發(fā)生發(fā)展的最重要的環(huán)境因素，早在早在1976年Ylitalo研究小組就發(fā)現(xiàn)了在慢性腎衰的大鼠中存在鹽敏感性，此后Koomans等人發(fā)現(xiàn)慢性腎衰的患者也存在鹽敏感性，但這種鹽敏感性的機(jī)制尚不完全清楚。腎素血管緊張素系統(tǒng)在慢性腎衰高血壓的形成與發(fā)展起著很重要的作用，除了循環(huán)的RAS參與了這樣過程，腦

33、部的RAS也同樣參與了高血壓的形成。旱在1995年Teruya等人就證實(shí)了鹽敏感性與腦血管緊張素有關(guān)，隨隨后Leenen研究小組在Dahl鹽敏感性大鼠的研究中發(fā)現(xiàn)高鹽可作用于腦部的腎素血管緊張素系統(tǒng)，而且鹽攝入與交感神經(jīng)活性呈正相關(guān)。在自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)，高鹽飲食引起的交感神經(jīng)過度活動(dòng)和血壓的惡化能夠被AT1受體阻斷劑氯沙坦阻止;在高鹽飲食的Dahl S大鼠，腦室內(nèi)注射氯沙坦阻止了交感神經(jīng)的過度活動(dòng)，抑制血壓的升高。可見中樞的R

34、AS與慢性腎衰鹽敏感性的形成密切相關(guān)，但具體機(jī)制尚不清楚。
　　 在腦內(nèi)存在所有RAS的組分，腦內(nèi)的RAS系統(tǒng)可通過調(diào)節(jié)交感神經(jīng)活性在血壓的調(diào)節(jié)中起著重要的作用，尤其與心血管調(diào)控系統(tǒng)有關(guān)的腦干區(qū)域(孤束核NTS、頭端腹外側(cè)核RVLM)。在這些區(qū)域中，孤束核是迷走神經(jīng)和舌咽神經(jīng)終端的起始部位，是調(diào)節(jié)壓力感受器反射和動(dòng)脈血壓調(diào)定點(diǎn)設(shè)置的重要區(qū)域。有研究證實(shí)在孤束核內(nèi)微量注射ANGⅡ可以消弱壓力感受器的敏感性，引起高血壓。循環(huán)中升高的

35、ANGⅡ可以通過血腦屏障作用有NTS，降低壓力感受器的敏感性，且腦內(nèi)注射AT1受體阻斷劑可以完全去除這一作用。從而推斷NTS里的RAS在血壓的調(diào)控中起著作用的作用。
　　 本研究以慢性腎衰大鼠為模型，通過用不同濃度的鹽對(duì)慢性腎衰大鼠進(jìn)行干預(yù)，觀察慢性腎衰大鼠腦部孤束核RAS變化，在高鹽飲食下給予腦內(nèi)注射氯沙坦，探索慢性腎衰大鼠鹽敏感性形成的機(jī)制。
　　 一、動(dòng)物模型的構(gòu)建與組織樣本的采集
　　 1、大鼠5/6腎切

36、除慢性腎衰模型制備及其鹽刺激
　　 大鼠體重200g左右行左側(cè)腎臟2/3切，一周后進(jìn)行右側(cè)腎全切（完全保留雙側(cè)的腎上腺），假手術(shù)大鼠只進(jìn)行腎包膜剝離。大鼠在手術(shù)后2、4、6、8、10周分別進(jìn)行眼眶靜脈采血，檢測(cè)大鼠血肌酐、尿素氮水平。在二期手術(shù)完成后的第9周，將假手術(shù)和一部分慢性腎衰大鼠隨機(jī)分組:
　　 2、高鹽慢性腎衰大鼠腦室注射沙坦鉀
　　 在二期手術(shù)完成后的第9周，將另一部分慢性腎衰大鼠隨機(jī)分組:
　

37、　 (1) CRF+高鹽飲食(n=15)
　　 (2) CRF+高鹽飲食+腦室內(nèi)注射人工腦脊液(I.C.V CSF，12μl/24h)(n=15)
　　 (3) CRF+高鹽飲食+腦室內(nèi)注射氯沙坦鉀(I.C.V losarta，1mg/kg體重d，體積12μl/24h)(n=15)
　　 分組后，測(cè)量尾動(dòng)脈血壓(softron BP-98A，Japan)作為基線血壓。
　　 腦室內(nèi)注射泵的植入:腦室內(nèi)注

38、射采用ALZET微滲透壓泵（型號(hào):2002）配合ALZET Brain Infusion Kit2套裝。第十周開始給予高鹽飲食刺激大鼠2周
　　 3、大鼠血、尿和腦組織的留取及處理
　　 1)術(shù)后第12周，測(cè)定大鼠血壓后將大鼠放于代謝籠中，留取24小時(shí)尿。
　　 2)腹腔注射麻醉大鼠:給大鼠腹腔注射3％戊巴比妥鈉麻醉，仰臥位固定于鼠臺(tái)上。
　　 3)開腹，腹主動(dòng)脈采血，采血后迅速打開胸腔，灌胃針從左心室穿

39、刺入主動(dòng)脈，同時(shí)剪開右心耳，4℃預(yù)冷的生理鹽水（含肝素20U/ml）200ml快速?zèng)_洗，可看到腎臟、肝臟、肺皮膚和肌肉等快速變蒼白，右心耳流出液體無色清亮
　　 4)每組部分老鼠（5只）4℃預(yù)冷的生理鹽水快速灌注后，換為4℃的4％多聚甲醛液(PH7.2)400ml灌注1.5h，之后小心剪開顱骨取腦，在大鼠腦模具內(nèi)，分離孤束核，置4％的多聚甲醛液內(nèi)固定，用于做腦組織石蠟切片的免疫組化。
　　 5)每組剩余的老鼠（5只）4℃

40、預(yù)冷的生理鹽水快速灌注后，開顱骨取腦，在大鼠腦模具內(nèi)，分離孤束核，包于錫箔紙中，液氮速凍，-80℃保存。
　　 二、檢測(cè)血中的肌酐、尿素氮、血鈉、24h尿蛋白、尿鈉
　　 三、Real-time PCR檢測(cè)腦內(nèi)孤束核腎素—血管緊張素系統(tǒng)AGT、ACE、AT1RmRNA水平的表達(dá)
　　 取各組大鼠孤束核組織放于1.5ml EP管，按組織重量:TRIZOL=1∶10的比例進(jìn)行反復(fù)吹打，提取組織RNA，逆轉(zhuǎn)錄，qRT-

41、PCR檢測(cè)AGT、ACE、AT1 mRNA水平的表達(dá)。
　　 四、免疫組化檢測(cè)腦內(nèi)孤束核腎素—血管緊張素系統(tǒng)AGT、ACE、ANGⅡ、AT1R蛋白水平的表達(dá)
　　 五、Western Blotting檢測(cè)孤束核組織ACE、AT1R蛋白水平的表達(dá)。
　　 將儲(chǔ)存于-80℃內(nèi)的組織取出，稱重，按組織重量∶裂解液=1∶4的比例加入裂解液，用5ml注射器反復(fù)吹打組織，以上操作均在冰上進(jìn)行，勻漿完全后，13000g，4℃離

42、心40min，去掉漂浮于上層的脂滴，提取中間層的勻漿液，即為孤束核組織的總蛋白，加入SDS(5×)上樣緩沖液，95℃煮沸蛋白，Western Blotting檢測(cè)孤束核組織ACE、AT1R蛋白水平的表達(dá)。
　　 六、統(tǒng)計(jì)方法
　　 所有數(shù)據(jù)均代表3次以上重復(fù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，所有統(tǒng)計(jì)分析由統(tǒng)計(jì)軟件SPSS13.0完成。與常數(shù)項(xiàng)比較，采用單樣本t檢驗(yàn);兩樣本均數(shù)的比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn);方差齊的多樣本均數(shù)的

43、比較采用One-WayANOVA，兩兩比較采用LSD法;方差不齊的多個(gè)樣本均數(shù)的比較采用Welch法，兩兩比較采用Dunnett's T3法。p＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1、腎衰大鼠模型的確立
　　 在二步法5/6腎切除術(shù)后的第10周，測(cè)量各組大鼠的體重、血壓并采血測(cè)定肌酐、尿素氮含量、24小時(shí)尿蛋白。在第10周時(shí)，各組大鼠的體重?zé)o明顯變化(p＜0.05)，而CRF組收縮壓、血肌酐和尿素

44、氮、24小時(shí)尿蛋白較Sham組均顯著升高(p＜0.05)。
　　 2.不同濃度飲食鹽對(duì)大鼠血壓的影響
　　 在Sham大鼠中，與正常鹽比較，給予低鹽或高鹽飲食14天均未能引起血壓的明顯改變(p＞0.05)。在CRF大鼠中，與正常鹽相比，給予低鹽飲食未引起血壓的顯著下降(p＞0.05)，而高鹽飲食引起血壓顯著升高(p＜0.05)。
　　 3.不同濃度飲食鹽對(duì)大鼠24h尿蛋白的影響
　　 在Sham大鼠中，與

45、正常鹽比較，給予低鹽或高鹽飲食14天均未能引起24h尿蛋白的明顯改變(p＞0.05))。在CRF大鼠中，與正常鹽相比，給予低鹽飲食未引起24h尿蛋白的顯著下降(p＞0.05)，而高鹽飲食引起24h尿蛋白顯著升高(p＜0.05)。
　　 4.不同濃度飲食鹽對(duì)大鼠體重、血鈉和尿鈉的影響
　　 無論在Sham還是CRF大鼠中，與正常鹽比較，給予低鹽或高鹽飲食14天對(duì)體重?zé)o顯著改變(p＞0.05)，但低鹽飲食減少尿鈉的排泄，高鹽

46、飲食增加尿鈉的排泄(p＜0.05);低鹽或高鹽飲食對(duì)Sham大鼠的血鈉無顯著改變(p＞0.05)，高鹽飲食升高CRF大鼠的血鈉(p＜0.05)。
　　 5.不同濃度飲食鹽對(duì)大鼠腦孤束核(NTS)部位RAS的影響
　　 5.1不同濃度飲食鹽下孤束核(NTS)部位RAS mRNA的表達(dá)
　　 在正常鹽飲食中，CRF大鼠腦部NTS部位AGT、ACEmRNA的表達(dá)與Sham大鼠相比顯著增強(qiáng)(p＜0.05);在低鹽飲食中，

47、CRF大鼠腦部NTS部位AGT、AT1mRNA的表達(dá)與Sham大鼠相比顯著增強(qiáng)(p＜0.05);在高鹽飲食中，CRF大鼠腦部NTS部位ACE、AT1 mRNA的表達(dá)與Sham大鼠相比顯著增強(qiáng)(p＜0.05);無論在Sham還是CRF大鼠中，與正常鹽相比，高鹽鹽飲食增加腦部NTS部位AGT、ACE、AT1mRNA的表達(dá)(p＜0.05)。
　　 5.2不同濃度飲食鹽下孤束核(NTS)部位RAS蛋白水平的表達(dá)
　　 無論在低鹽

48、、正常鹽或是高鹽飲食中，CRF大鼠腦部NTS部位AGT、ACE、ANGⅡ、AT1的表達(dá)與Sham大鼠相比顯著增強(qiáng)(p＜0.05);在Sham大鼠中，與正常鹽相比，低鹽飲食抑制腦部NTS部位AGT、ACE、ANGⅡ、AT1的表達(dá)(p＜0.05)，高鹽無明顯改變;在CRF大鼠中，與正常鹽相比，低鹽飲食抑制腦部NTS部位AGT、ACE、ANGⅡ、AT1的表達(dá)(p＜0.05)，高鹽飲食增加腦部NTS部位AGT、ACE、ANGⅡ、AT1的表達(dá)(p

49、＜0.05)。
　　 6.腦室內(nèi)注射氯沙坦鉀對(duì)高鹽飲食的慢性腎衰竭大鼠血壓的影響
　　 在高鹽飲食的CRF大鼠中，與高鹽CRF大鼠相比，給予腦室內(nèi)注射CSF對(duì)血壓無明顯影響，而腦室內(nèi)注射氯沙坦時(shí)血壓明顯下降(p＜0.05)。
　　 7.腦室內(nèi)注射氯沙坦鉀對(duì)高鹽飲食的慢性腎衰竭大鼠24h尿蛋白的影響
　　 在高鹽飲食的CRF大鼠中，與高鹽CRF大鼠相比，給予腦室內(nèi)注射CSF對(duì)24h尿蛋白無明顯影響，而腦室內(nèi)

50、注射氯沙坦時(shí)24h尿蛋白明顯下降(p＜0.05)。
　　 8.腦室內(nèi)注射氯沙坦鉀對(duì)高鹽飲食的慢性腎衰竭大鼠腦孤束核(NTS)部位RAS的影響
　　 8.1腦室內(nèi)注射氯沙坦鉀時(shí)高鹽飲食的慢性腎衰竭大鼠孤束核(NTS)部位RASmRNA的表達(dá)
　　 在高鹽飲食的CRF大鼠中，給予腦室內(nèi)注射氯沙坦，觀察其對(duì)NTS部位RASmRNA的影響情況，結(jié)果顯示:與高鹽CRF大鼠相比，腦室內(nèi)注射氯沙坦抑制AGT、ACE、AT1R

51、mRNA的表達(dá)(p＜0.05)。
　　 8.2腦室內(nèi)注射氯沙坦鉀時(shí)高鹽飲食的慢性腎衰竭大鼠孤束核(NTS)部位RAS蛋白水平的表達(dá)
　　 在高鹽飲食的CRF大鼠中，與高鹽CRF大鼠相比，給予腦室內(nèi)注射CSF對(duì)NTS部位AGT、ACE、ANGⅡ、AT1均無明顯影響(p＞0.05)，而腦室內(nèi)注射氯沙坦時(shí)NTS部位AT1表達(dá)明顯減少，反饋性引起AGT、ACE、ANGⅡ表達(dá)顯著升高(p＜0.05)。
　　 結(jié)論：