高膽固醇血癥大鼠心肌組織易損性增加的機制——心肌細胞膜流動性，髓過氧化物酶和部分G蛋白偶聯(lián)受體自身抗體的可能作用.pdf

1、本研究擬在食源性HC大鼠模型的基礎上，探討心肌細胞膜流動性、MPO和部分G蛋白偶聯(lián)受體自身抗體在HC心肌易損性增加中的作用及其部分相關機制。 第一部分，高膽固醇血癥誘發(fā)大鼠心肌細胞膜流動性降低。 目的：本部分實驗在食源性HC大鼠模型上，給予吡格列酮(Pioglitazone，PIO)干預，觀察并分析HC大鼠心肌細胞膜流動性和心肌損傷的變化，探討心肌細胞膜流動性在HC大鼠心肌易損性增加中的作用及其病理機制。 材料與

2、方法： 1．材料: 健康Wistar遠交群大鼠，4～5weeks，體重110±10g，雄性。 2．實驗分組: (1)食源性HC大鼠模型分組:①普通飲食大鼠組；②Vehicle+高膽固醇飲食組；③PIO+高膽固醇飲食組。 (2)在體大鼠心臟局部缺血/再灌注后心肌梗塞面積測定的實驗分組：①偽手術組;②缺血/再灌注+普通飲食大鼠組;③缺血/再灌注+Vehicle+高膽固醇飲食組；④缺血/再灌注+PIO

3、+高膽固醇飲食組。 3．方法: (1)實驗模型的建立及標本的留取:①食源性HC大鼠模型的建立及標本留取：②大鼠在體頸總動脈插管及標本留??；③單個心肌細胞的分離及標本留??；④大鼠在體心臟局部缺血/再灌注模型的建立及標本留取。 (2)檢測指標的測定：①大鼠空腹血清總膽固醇(Total Cholesterol，TC)、甘油三酯(Triglyceride，TG)和低密度脂蛋白—膽固醇(Low Density Lipopr

4、otein Cholesterol，LDL—cho)的測定；②心功能測定；③心肌細胞膜Na+—K+—ATPase活性的測定；④心肌細胞膜膽固醇含量、磷脂含量和膽固醇/磷脂比值(C/P)的測定；⑤心肌細胞膜流動性的測定；⑥心肌組織cAMP含量的測定；⑦大鼠心肌梗塞面積的測定；⑧心肌細胞膜流動性與心功能和缺血/再灌注后心肌梗塞面積的相關性分析。 小結: 1．HC引起大鼠心功能下降，缺血/再灌注后心梗面積明顯增大，提示在HC時

5、心肌損傷易感性增加； 2．HC導致心肌細胞膜Na+—K+—ATPase活性降低，膜流動性下降，膜C/P比值升高，心肌細胞cAMP含量降低，而且膜流動性與心功能和心梗面積具有相關性，提示HC可能通過膜流動性降低，進而心肌細胞跨膜信號轉導功能受阻，最終導致HC情況下心功能受神經體液調控能大下降而惡化心肌損仿； 3．PIO干預顯著抑制HC誘導的心肌細胞膜C/P升高和膜流動性的下降以及膜Na+—K+—ATPase活性降低，以及細

6、胞cAMP含量的減少，恢復心功能和減小缺血/再灌注后心梗面積。進一步提示HC大鼠心肌細胞膜流動性改變可能是HC大鼠心肌易損性增加的原因之一。 第二部分, 髓過氧化物酶對高膽固醇血癥大鼠缺血/再灌注心肌易損性增加的作用。 目的：本部分實驗通過觀察HC大鼠缺血/再灌注心肌組織MPO分布和活性的變化，以及這一變化與HC大鼠MUR損傷之間的關系，說明MPO在HC大鼠缺血/再灌注心肌易損性增加中所發(fā)揮的作用并探討其所涉及的部分損傷

7、機制(如：NO有效利用率的下降等)。 材料和方法： 1．材料： (1)健康Wistar遠交群大鼠，4～5weeks體重110±10g，雄性；(2)H9c2(2-1)細胞株。 2．實驗分組： (1)食源性HC大鼠模型分組：①普通飲食大鼠組；②Vehicle+高膽固醇飲食組；③ABAH+高膽固醇飲食組。 (2)在體大鼠心臟局部缺血/再灌注后心肌梗塞面積測定的實驗分組: ①偽手術組；②缺血/再灌

8、注+普通飲食大鼠組；③缺血/再灌注+Vehicle+高膽固醇飲食組；④缺血/再灌注+ABAH+高膽固醇飲食組。 (3)H9c2(2-1)細胞株實驗分組：①常氧組(Control)；②ABAH+常氧組；③缺氧/復氧組(H/R)；④MPO+缺氧/復氧組；⑤ABAH+缺氧/復氧組；⑥ABAH+MPO+缺氧/復氧組。 3．方法： (1)實驗模型的建立及標本的留?。孩偈吃葱訦C大鼠模型的建立及標本的留?。虎诖笫笤隗w心臟局部

9、缺血/再灌注模型的建立及標本的留取；③H9c2(2-1)細胞缺氧/復氧模型的建立及標本的留取。 (2)檢測指標的測定：①大鼠空腹血清總膽固醇(Total Cholesterol，TC)、甘油三酯(Triglyceride，TG)和低密度脂蛋白—膽固醇(Low Density Lipoprotein Cholesterol，LDL—cho)的測定；②血清和培養(yǎng)液上清肌酸激酶(Creatine Kinase，CK)含量的測定；③血清

10、和培養(yǎng)液上清乳酸脫氫酶(Lactate Dehydrogenase，LDH)含量的測定；④DNA原位末端缺口標記法(TUNEL)檢測心肌細胞凋亡；⑤心肌細胞caspase-3相對活性檢測；⑥大鼠缺血/再灌注后心肌梗塞面積的測定；⑦大鼠心功能監(jiān)測；⑧免疫組織化學染色檢測心肌組織MPO分布；⑨心肌組織MPO活性檢測；⑩心肌組織MPO活性與血清CK含量、LDH含量、凋亡指數(shù)、caspase-3活性、心肌梗塞面積和心功能的相關性分析；()心肌組

11、織一氧化氮(nitric oxide，NO)含量測定：()放射性免疫試劑盒測定心肌組織cGMP含量；()Western—blot檢測心肌組織一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)的蛋白表達；()實時定量PCR法檢測心肌組織NOS的mRNA表達；(15)細胞計數(shù)Kit-8檢測H9c2(2-1)細胞增殖。 小結： 1．HC大鼠心肌組織MPO含量和活性明顯升高，提示MPO活性的改變可能是HC使缺血/

12、再灌注后心肌損傷惡化的原因之一； 2．HC大鼠缺血/再灌注后心肌組織MPO含量和活性顯著升高的同時NO/cGMP通路受損，NO生物利用率下降，進一步提示我們HC缺血/再灌注后心肌損傷易感性增加可能部分是通過MPO活性的改變影響NO—cGMP信號通路來實現(xiàn)。 第三部分，高膽固醇血癥誘導大鼠血清α1—、β1—腎上腺素受體和M2-膽堿受體自身抗體的產生。 目的：本部分實驗首先選擇α1—AA、β1—AA、β3—AA、M2

13、-AA和AT1—AA陰性的健康雄性大鼠建立食源性HC大鼠模型：進而觀察食源性HC是否會誘發(fā)G蛋白偶聯(lián)受體自身抗體的產生；如果會，則進一步了解自身抗體的產生情況及其作用。 材料和方法： 1．材料：健康Wistar遠交群大鼠，4～5weeks體重110±10g，雄性。 2．實驗分組：食源性HC大鼠模型分組：①普通飲食大鼠組；②高膽固醇飲食6周組；③高膽固醇飲食10周組。 3．方法： (1)實驗模型的建

14、立及標本的留取。 食源性HC大鼠模型的建立及標本的留取。 (2)檢測指標的測定：①大鼠空腹血清總膽固醇(Total Cholesterol，TC)、甘油三酯(Triglyceride，TG)和低密度脂蛋白-膽固醇(Low Density Lipoprotein Cholesterol，LDL—cho)的測定；②心肌組織石蠟切片的HE染色；③心肌組織超微結構電鏡觀察；④血清受體自身抗體(α1—AA、β1—AA、β3—AA、

15、M2-AA和AT1—AA)的測定；⑤流式細胞儀檢測大鼠脾臟淋巴細胞CD4+/CD8+和淋巴細胞含量。 (3)肽段合成及自身抗體的測定： 5種抗原肽段由吉爾生化上海有限公司合成，分別相當于α1—AR、β1—AR、β3—AR、M2-AR和AT1—AR細胞外第二環(huán)氨基酸序列的特異性抗原決定簇，合成肽段純度為90％～95％。用ELISA法檢測血清中各自身抗體的含量。 小結： 1．本研究首次在HC大鼠血清中發(fā)現(xiàn)了α

16、1—AA、β1—AA和M2-AA等G蛋白偶聯(lián)受體自身抗體。 2．HC大鼠心肌超微結構和脾臟免疫系統(tǒng)功能發(fā)生改變，提示HC有可能通過引起心肌重構并激活機體免疫系統(tǒng)，從而誘發(fā)部分G蛋白偶聯(lián)受體自身抗體產生，并進一步影響HC大鼠心臟功能。 結論： 1．HC可以誘發(fā)心肌細胞膜脂質比例失調，降低心肌細胞膜流動性，引起心肌細胞功能障礙，從而導致心肌損傷加重；有效的改善心肌細胞膜流動性可以減輕心肌細胞損傷。提示心肌細胞膜流動性