血管過氧化物酶1介導(dǎo)高血壓心肌重構(gòu)及機制研究.pdf

1、研究背景:心肌組織受容量或壓力負荷、神經(jīng)體液激素及細胞因子等各種因素誘導(dǎo)所致心肌重構(gòu)，即心肌肥大和心肌炎性浸潤及纖維化改變，不僅是心血管疾病發(fā)病率和病死率的獨立危險因素，也是導(dǎo)致慢性心力衰竭的首要原因。近年來大量研究表明氧化應(yīng)激在心肌重構(gòu)中扮演了重要作用，上述多種因素可通過激活NADPH氧化酶(NOX)產(chǎn)生大量活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)，其活性成分超氧陰離子(O2-)和過氧化氫(H2O2)活化

2、下游氧化還原及促炎相關(guān)信號傳導(dǎo)通路，從而促使心肌細胞肥大、膠原纖維增加等病理生理過程的發(fā)展，最終引起心臟結(jié)構(gòu)和功能改變。
　　血管過氧化物酶1(vascular peroxide1，VPO1)是新近發(fā)現(xiàn)的一種心血管系統(tǒng)中的過氧化物酶家族成員。作為NADPH氧化酶下游信號傳導(dǎo)中一種酶，VPO1通過催化NOX來源的H2O2生成更強的氧化劑次氯酸(hypochlorous acid，HOCl)，進一步放大氧化應(yīng)激效應(yīng)。我們新近研究證據(jù)顯

3、示NOX/VPO1信號通路介導(dǎo)的氧化應(yīng)激在心肌缺血再灌注損傷，內(nèi)皮細胞凋亡和平滑肌細胞增殖過程中有著重要作用。鑒于氧化應(yīng)激在心肌重構(gòu)中的重要作用，我們推測VPO1可能介導(dǎo)了高血壓心肌重構(gòu)，本研究首先在動物水平探討VPO1與高血壓心肌重構(gòu)的相關(guān)性，在此基礎(chǔ)上，從細胞水平進一步研究VPO1介導(dǎo)心肌重構(gòu)及其相關(guān)機制。
　　第一部分VPO1介導(dǎo)高血壓大鼠心肌重構(gòu)
　　目的:探討VPO1是否參與了自發(fā)性高血壓大鼠心肌肥大及纖維化過程。

4、
　　方法:20周齡雄性自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneouslyhypertensive rat)12只，即高血壓組（SHR組，n=12），12只同齡雄性Wistar-Kyoto大鼠作為正常血壓對照組（WKY組，n=12），測量尾動脈收縮壓，并用超聲心動儀檢測心臟形態(tài)學(xué)及相關(guān)心功能指標。采用HE染色觀察心肌組織病理變化，Masson染色觀察心肌組織中膠原含量變化，免疫組織化學(xué)方法檢測心肌組織中VPO1蛋白表達水平、Wester

5、n blot（免疫印跡法）測定心肌組織中Nox2、Nox4和VPO1蛋白的表達水平，RT-PCR方法測定心肌組織中Nox2、Nox4、VPO1以及Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA的表達水平。
　　結(jié)果:與WKY正常血壓組大鼠相比，SHR組大鼠血壓顯著升高，心室出現(xiàn)明顯的向心性肥厚，心肌細胞體積增大和膠原纖維含量增加，心臟舒張功能明顯降低;SHR組心肌組織中Nox2、Nox4和VPO1蛋白和mRNA的表達顯著上調(diào);SHR組心肌組織中的Ⅰ、Ⅲ型膠

6、原纖維mRNA表達增加。
　　結(jié)論:
　　VPO1可能參與了高血壓大鼠的心臟重構(gòu)，其機制可能涉及NOX/VPO1信號通路。
　　第二部分VPO1介導(dǎo)AngⅡ誘導(dǎo)心肌細胞重構(gòu)及相關(guān)機制
　　目的:探討VPO1是否介導(dǎo)了AngⅡ誘導(dǎo)心肌細胞重構(gòu)及相關(guān)機制
　　方法:
　　(1)研究AngⅡ處理心肌細胞(H9c2)對VPO1表達水平的影響。量效實驗分組:對照組和不同濃度的AngⅡ組（用含10-7M，10-6

7、 M，10-5M AngⅡ的培養(yǎng)液孵育H9c2細胞24h）。時效實驗分組:對照組和根據(jù)量效實驗所確定的最佳AngⅡ濃度處理不同時間組(12h，24h，48h)。采用Real-Time PCR及Western-blot法分別從基因及蛋白水平檢測VPO1表達水平。
　　(2)研究NADPH氧化酶抑制劑二苯基碘(DPI)、過氧化氫水解酶(catalase)和VPO1抑制劑氨基苯甲酰肼(aminobenzoic acidhydrazide

8、，ABAH)分別預(yù)處理對AngⅡ誘導(dǎo)H9c2細胞VPO1表達水平、心肌細胞肥大、纖維化以及相關(guān)途徑影響。實驗分組:空白對照組:用含1％小牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液孵育H9c2細胞24h; AngⅡ組:用含10-6 M AngⅡ的培養(yǎng)液孵育H9c2細胞24h;+抑制劑組（三組）:分別用100μM DPI，300μM catalase，400μMABAH預(yù)處理H9c2細胞2h后，加入終濃度為10-6 M的AngⅡ培養(yǎng)液孵育H9c2細胞24h

9、，采用Real-Time PCR及Western-blot法分別從基因及蛋白水平檢測Nox2、Nox4、VPO1表達;心肌細胞肥大評價:結(jié)晶紫染色后拍照并用Image J軟件分析心肌細胞表面積，采用Real-time PCR測定BNP、ANF mRNA水平;心肌細胞纖維化評價:采用Real-time PCR測定Ⅰ、Ⅲ型膠原纖維mRNA表達水平，并用天狼猩紅染色測定纖維膠原含量;VPO1介導(dǎo)AngⅡ誘導(dǎo)心肌重構(gòu)相關(guān)機制研究:分別測定各組心

10、肌細胞中MAPK(p-38、p-ERK、p-JNK)蛋白表達水平。細胞內(nèi)H2O2和HOC1水平分別通過酶聯(lián)免疫法(ELISA)和3-氯酪氨酸蛋白免疫組化染色檢測。
　　結(jié)果:
　　(1)AngⅡ誘導(dǎo)心肌細胞VPO1水平表達增高呈濃度依賴性，并能被NADPH氧化酶抑制劑(DPI)及catalse抑制。
　　(2)與對照組相比，AngⅡ(10-6M)處理H9c2細胞24 h顯著上調(diào)細胞Nox2，VPO1表達水平(P＜0.0

11、1)，并升高BNP、ANF、Ⅰ、Ⅲ型膠原纖維mRNA水平的表達(P＜0.01)，及纖維膠原含量。同時AngⅡ能誘導(dǎo)H9c2細胞內(nèi)H2O2和3-氯酪氨酸蛋白生成增加。NADPH氧化酶抑制劑DPI、catalase及VPO1抑制劑(ABAH)預(yù)處理可不同程度抑制AngⅡ的上述作用。
　　(3)AngⅡ誘導(dǎo)心肌細胞重構(gòu)同時，能顯著上調(diào)了MAPK（p-38、p-ERK、p-JNK）蛋白表達水平，DPI、catalase能不同程度抑制MAP