IRAS基因敲除小鼠的構(gòu)建及相互作用蛋白的篩選.pdf

1、上世紀(jì)80年代Bousquet最早提出了咪唑啉受體的概念。此后研究者們采用藥理學(xué)和分子生物學(xué)等技術(shù)對(duì)該受體的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行了深入的研究。首先,研究者采用藥理學(xué)技術(shù)將該受體與經(jīng)典a2-腎上腺素受體相區(qū)別,并在此基礎(chǔ)上將該受體分為多種亞型,發(fā)現(xiàn)I1咪唑啉受體參與了中樞血壓調(diào)節(jié)、藥物依賴(lài)、腎臟排鈉利尿、胃酸分泌以及胰島素分泌等過(guò)程;然而,由于在前期研究工作中沒(méi)有選擇性I1咪唑啉受體阻斷劑,使得針對(duì)I1咪唑啉受體功能的深入研究受到了極大限制。其

2、后,研究者采用分子生物學(xué)技術(shù)針對(duì)I1咪唑啉受體開(kāi)展了大量研究工作。Piletz用咪唑啉受體抗血清從人的海馬cDNA文庫(kù)中克隆得到了I1咪唑啉受體候選蛋白(IRAS),但目前仍缺乏直接的實(shí)驗(yàn)證據(jù)證實(shí)IRAS就是I1咪唑啉受體,也沒(méi)有有效的整體動(dòng)物模型用于評(píng)價(jià)IRAS在血壓調(diào)節(jié)、激素分泌及藥物依賴(lài)等生理及病理生理過(guò)程中的意義。此外在前期的研究中,IRAS一方面存在多種潛在的剪接異構(gòu)體,另一方面參與多種生理功能,例如抑制細(xì)胞遷移、抗凋亡以及調(diào)

3、節(jié)阿片系統(tǒng)功能等等,然而有關(guān)上述多種剪接異構(gòu)體與IRAS功能之間的關(guān)系尚有待深入研究?；谏鲜鲅芯抗ぷ骰A(chǔ),我們本次工作的主要內(nèi)容就是構(gòu)建IRAS條件性基因敲除小鼠,為I1咪唑啉受體/IRAS蛋白的功能研究提供整體水平上的高選擇性研究模型;同時(shí)本課題計(jì)劃采用酵母雙雜交方法篩選與不同的IRAS片段相互作用的蛋白,試圖在分子水平為研究IRAS蛋白的功能提供有益的線索。
　　一、IRAS基因敲除小鼠的構(gòu)建及初步表型篩選
　　首先針

4、對(duì)小鼠IRAS蛋白編碼基因進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)可操作外顯子為第4和第5外顯子,因此構(gòu)建了分別錨定兩個(gè)外顯子的兩個(gè)打靶載體。由于第5外顯子與第6外顯子相距較近,為了盡量減少對(duì)基因組結(jié)構(gòu)的影響,在構(gòu)建打靶載體1時(shí)將這兩個(gè)外顯子放在一起進(jìn)行操作;長(zhǎng)臂放在了錨定序列的上游,這樣除第4外顯子外序列均為內(nèi)含子,避免了對(duì)基因組結(jié)構(gòu)的影響;將短臂放在下游,含7、8、9外顯子。根據(jù)骨架載體的特點(diǎn)將長(zhǎng)臂置于neo基因上游,將錨定序列和短臂置于neo基因下游,并在

5、中間插入了loxP序列。針對(duì)該打靶載體,長(zhǎng)片段PCR上游引物來(lái)自錨定序列和短臂之間(loxP序列),下游引物定位在短臂外側(cè)。此外,利用5’southern blot進(jìn)行篩選時(shí)使用SpeI酶切,野生帶11kb,重組帶7kb;3’southern blot用EcoRI酶切,野生帶21kb,重組帶為14kb。打靶載體構(gòu)建成功后,經(jīng)酶切和測(cè)序驗(yàn)證外顯子和loxP序列正確。線性化處理后電轉(zhuǎn)小鼠ES細(xì)胞,正負(fù)加壓培養(yǎng)。將打靶載體1電轉(zhuǎn)小鼠ES細(xì)胞后

6、共獲得304個(gè)ES細(xì)胞克隆,loxP陽(yáng)性208個(gè),但長(zhǎng)片段PCR和southern blot篩選均未發(fā)現(xiàn)同源重組克隆。
　　打靶載體2主要錨定第4外顯子,同樣長(zhǎng)臂包含在上游內(nèi)含子內(nèi),短臂在下游涵蓋第5、6外顯子。根據(jù)骨架載體特點(diǎn)將長(zhǎng)臂和錨定序列置于neo基因上游,中間插入loxP序列,短臂則放在了neo基因下游。長(zhǎng)片段PCR上游引物在neo基因的3’端,下游引物則在短臂的外側(cè)。將打靶載體2電轉(zhuǎn)小鼠ES細(xì)胞后共獲得366個(gè)ES細(xì)胞克

7、隆,loxP陽(yáng)性268個(gè),經(jīng)長(zhǎng)片段PCR篩選最終得到陽(yáng)性ES細(xì)胞克隆三個(gè)(2-11B、1-10A、2-3D),其中2-11B囊胚注射后得到嵌合體小鼠,與C57小鼠交配獲得重組雜合子小鼠。之后用C57小鼠進(jìn)行擴(kuò)增,得到穩(wěn)定的基因型,再與EII-cre小鼠進(jìn)行交配,得到IRAS完全敲除的小鼠。同時(shí),將重組小鼠與flp小鼠雜交,可特異性剔除基因組中neo序列(兩端有FRT序列),得到IRAS基因被兩個(gè)loxP錨定(floxed)的小鼠,可用于

8、進(jìn)一步的條件性基因敲除小鼠的制備。
　　得到上述重組雜合子小鼠、敲除小鼠以及floxed小鼠后對(duì)其進(jìn)行鑒定。針對(duì)重組雜合型小鼠在基因組水平進(jìn)行鑒定,采用ES細(xì)胞篩選時(shí)用到的loxP兩端引物對(duì)重組雜合子小鼠基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增,結(jié)果產(chǎn)物中除了重組帶和野生帶以外出現(xiàn)比重組帶大的第三條帶,實(shí)驗(yàn)證實(shí)它是重組片段和野生片段退火形成的,參考實(shí)際的測(cè)序結(jié)果,推測(cè)其是一條重組片段單鏈和兩條野生片段單鏈退火形成的產(chǎn)物。針對(duì)floxed小鼠在下游lo

9、xP的前后設(shè)計(jì)引物,結(jié)果野生帶和重組帶大小均正確。針對(duì)敲除小鼠在基因組水平和mRNA水平進(jìn)行鑒定,采用ES細(xì)胞篩選時(shí)用到的loxP正向引物以及floxed小鼠鑒定時(shí)用到的反向引物對(duì)敲除小鼠基因組進(jìn)行PCR可獲得特異性敲除帶,再用ES細(xì)胞篩選時(shí)用到的長(zhǎng)片段引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果與設(shè)計(jì)的相同。另外,提取敲除小鼠肝臟總RNA,反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行real-time PCR,結(jié)果顯示,以第3和第5外顯子上的引物進(jìn)行擴(kuò)增得到正常的擴(kuò)增曲線,但P

10、CR產(chǎn)物的長(zhǎng)度縮短,而以第2和第4外顯子上的引物進(jìn)行擴(kuò)增,未能得到擴(kuò)增曲線,說(shuō)明mRNA轉(zhuǎn)錄正常,但成熟的mRNA缺少第4外顯子,并且以此進(jìn)行分析,在之后的第5外顯子中會(huì)出現(xiàn)終止密碼子。取野生型和敲除型動(dòng)物的小腦提取蛋白進(jìn)行western blot檢測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn)針對(duì)IRAS的N末端的抗體在130kD附近發(fā)現(xiàn)一條差異條帶,針對(duì)C末端的抗體在95至130kD之間檢測(cè)到3條差異條帶,該結(jié)果提示小鼠IRAS蛋白有可能是以某種剪切異構(gòu)體形式存在的

11、。
　　獲得足夠量的完全敲除和野生型動(dòng)物后,我們對(duì)敲除動(dòng)物的表型進(jìn)行了初步分析。結(jié)果如下:
　　1.生殖方面,雜合型動(dòng)物在形成配子時(shí),野生型配子和敲除型配子的比例沒(méi)有明顯區(qū)別。
　　2.發(fā)育方面,出生后第3周、第7周和第11周,野生型動(dòng)物的體重明顯高于敲除型動(dòng)物。并且這種體重差異在斷乳前就已存在,進(jìn)一步取第15天和第12天的胚胎進(jìn)行觀察,發(fā)現(xiàn)敲除型動(dòng)物的發(fā)育遲緩開(kāi)始于胚胎期。
　　3.敲除型動(dòng)物出生后易發(fā)生死亡。

12、尸檢觀察動(dòng)物存在嚴(yán)重感染,已形成大葉性肺炎。
　　4.敲除型動(dòng)物的攝食量明顯低于野生型動(dòng)物。但兩種基因型動(dòng)物的體溫沒(méi)有差別。
　　5.IRAS基因敲除后動(dòng)物空腹血糖升高,且口服糖耐量明顯低于野生型動(dòng)物,說(shuō)明IRAS基因可能參與血糖的代謝。
　　6.自發(fā)活動(dòng)實(shí)驗(yàn)中,中心區(qū)停留時(shí)間結(jié)果敲除型動(dòng)物高于野生型。但開(kāi)場(chǎng)實(shí)驗(yàn)各項(xiàng)指標(biāo)野生型和敲除型動(dòng)物沒(méi)有區(qū)別。
　　7.抓力和轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示兩種基因型動(dòng)物的神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能沒(méi)有區(qū)

13、別。
　　8.水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示兩種動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶能力沒(méi)有區(qū)別。
　　9.前脈沖抑制試驗(yàn)中兩種動(dòng)物的結(jié)果沒(méi)顯著區(qū)別,說(shuō)明IRAS基因參與精神分裂癥的可能性不大。
　　10.懸尾和強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示敲除型動(dòng)物的不動(dòng)時(shí)間縮短,說(shuō)明IRAS基因敲除后動(dòng)物情緒可能受到影響。
　　11.熱板和甩尾實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示敲除型動(dòng)物的基礎(chǔ)痛閾低于野生型動(dòng)物,說(shuō)明IRAS基因可能參與痛覺(jué)的形成過(guò)程。
　　12.阿片類(lèi)物質(zhì)作用方面,

14、嗎啡及美沙酮對(duì)敲除動(dòng)物的鎮(zhèn)痛作用明顯弱于相同劑量藥物對(duì)野生型的作用。長(zhǎng)期給藥后敲除型動(dòng)物更容易形成耐受。納洛酮催促實(shí)驗(yàn)中敲除型動(dòng)物出現(xiàn)跳躍的比例明顯高于野生型。這些結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)室前期發(fā)現(xiàn)的胍丁胺對(duì)阿片系統(tǒng)功能的調(diào)節(jié)作用相一致,初步提示IRAS是胍丁胺發(fā)揮―阿片系統(tǒng)雙向調(diào)節(jié)劑‖作用的物質(zhì)基礎(chǔ)?；谝陨涎芯抗ぷ?我們通過(guò)構(gòu)建打靶載體,得到了三株重組陽(yáng)性的小鼠胚胎干細(xì)胞,而后獲得重組雜合型小鼠,并獲得全身敲除小鼠和floxed小鼠,全身敲除小

15、鼠的表型有以下四個(gè)方面:發(fā)育遲緩、血糖升高、痛閾降低同時(shí)對(duì)嗎啡的反應(yīng)出現(xiàn)雙向變化,動(dòng)物抑郁樣情緒發(fā)生變化。
　　二、相互作用蛋白的篩選及鑒定
　　在酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)中,首先采用生物信息學(xué)研究方法,針對(duì)IRAS蛋白不同的功能結(jié)構(gòu)域?qū)⑵浞殖闪?選擇其中五段作為誘餌,在人胚胎腦表達(dá)文庫(kù)中篩選與IRAS發(fā)生相互作用的蛋白,結(jié)果獲得3個(gè)陽(yáng)性克隆。以IRAS 621-870氨基酸為誘餌篩選得到SERTAD1的全序列,NCBI gene

16、ID:29950,主要功能為細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、促進(jìn)增殖以及抗細(xì)胞凋亡作用;以IRAS 431~620氨基酸為誘餌篩選得到SORL1的羧基端1700aa之后的多肽,NCBI gene ID:6653,與老年癡呆發(fā)病有關(guān),主要功能為參與淀粉樣蛋白的胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn);以IRAS 621-870氨基酸為誘餌篩選得到USP11羧基端654aa之后的多肽,NCBI gene ID:8237,是一種去泛素化酶。在此基礎(chǔ)上以SERTAD1為對(duì)象我們進(jìn)行蛋白間相互作

17、用的驗(yàn)證。首先在酵母雙雜交回轉(zhuǎn)驗(yàn)證和免疫共沉淀試驗(yàn)中,誘餌片段(IRAS 621-870aa)與SERTAD1存在相互作用;進(jìn)一步采用免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)證實(shí)全長(zhǎng)IRAS與SERTAD1存在相互作用。采用熒光共振能量轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),IRAS與SERTAD1之間的FRET值在0.16左右,表明二者間的相互作用較弱,但不能排除是由于IRAS分子量過(guò)大造成一定的空間位阻而影響熒光能量的轉(zhuǎn)移。在上述研究基礎(chǔ)上,我們用免疫共沉淀的方法觀察I1咪唑啉受體激

18、動(dòng)劑莫索尼定和胍丁胺對(duì)兩種蛋白間相互作用的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)上述藥物并不能增強(qiáng)或減弱兩種蛋白間的相互作用。為了確定兩種蛋白間發(fā)生相互作用的具體肽段,我們還采用免疫共沉淀的方法發(fā)現(xiàn)SERTAD1還能與IRAS蛋白的潛在剪接體(512-1504)發(fā)生相互作用,而不能與潛在剪接體(1152-1504)發(fā)生相互作用。進(jìn)一步采用哺乳動(dòng)物雙雜交的研究方法,我們確定了IRAS蛋白序列中與SERTAD1發(fā)生相互作用的是(621-700aa)肽段,即預(yù)測(cè)的卷

19、曲螺旋區(qū)。由于SERTAD1與腫瘤發(fā)生密切相關(guān),因此人們將其定義為癌基因的一種?；诖?我們找到了與兩蛋白間相互作用有關(guān)的IRAS內(nèi)部特異性片段,為下一步研究IRAS在腫瘤方面的相關(guān)功能奠定了基礎(chǔ)。
　　基于第二部分研究工作,我們采用酵母雙雜交方法發(fā)現(xiàn)了三個(gè)與IRAS蛋白發(fā)生相互作用的生理性肽段,并對(duì)其中SERTAD1與IRAS的相互作用進(jìn)行了全面系統(tǒng)的驗(yàn)證,為進(jìn)一步研究IRAS在腫瘤發(fā)生過(guò)程中的作用奠定了基礎(chǔ)。
　　總之,