大鼠睪丸酵母雙雜交cDNA文庫的構(gòu)建及與JUNO相互作用蛋白的初步篩選.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、受精作用因單倍體精子和卵子融合創(chuàng)造出新的基因不同的二倍體有機體而對物種的延續(xù)和發(fā)展有著重要的意義。精卵融合是完成受精作用的關(guān)鍵，是由多分子參與的復雜過程，但目前為止還尚不明確其分子機制。研究精卵融合過程中的蛋白間相互作用，對了解并解決其中存在的問題有著不可估量的價值。IZUMO1-JUNO間相互作用是精卵融合過程中最為關(guān)鍵的蛋白相互作用，缺少其中任何一個都無法正常的受精。因此本實驗選擇JUNO蛋白作為研究對象，篩選除IZUMO1外與其相

2、互作用的蛋白。
　　1、大鼠睪丸酵母雙雜交cDNA文庫的構(gòu)建
　　本實驗通過采用SMARTTM cDNA合成技術(shù)構(gòu)建了大鼠睪丸的酵母雙雜交文庫。構(gòu)建的文庫庫容為1.5×106 cfu，滴度為8×107 cfu/mL，重組率為78％，插入片段平均長度為0.7 kb，有較高的進行蛋白相互作用篩選的價值。
　　2、pGBKT7-juno誘餌載體的構(gòu)建
　　以實驗室克隆并保存的pMD19T-juno為模板，去掉信號肽擴增

3、后連接到pGBKT7載體上，并對其進行鑒定、自激活檢測和細胞毒性檢測。通過利用載體上c-Myc抗原標簽，western blot檢測了pGBKT7-juno誘餌載體在酵母細胞中表達情況。使用生物信息學分析常見哺乳動物的JUNO氨基酸序列，繪制了系統(tǒng)發(fā)生樹，分析了在進化過程中的親緣關(guān)系。
　　3、酵母雙雜交篩選與JUNO相互作用蛋白
　　使用構(gòu)建好的大鼠睪丸酵母雙雜交cDNA文庫和pGBKT7-juno誘餌載體進行雜交。共篩選

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