農桿菌介導的南瓜耐鹽相關基因CmP5CS遺傳轉化菜用大豆.pdf

1、菜用大豆[Glycine max(L.)Mer.]營養(yǎng)價值高，深受消費者青睞。隨著市場需求的擴大，其栽培面積正迅速增加。而土壤鹽漬化和次生鹽漬化的日益加劇，使菜用大豆的產量和品質受到嚴重影響。本研究從耐鹽南瓜砧木品種中克隆了脯氨酸合成酶基因CmP5CS，并遺傳轉化菜用大豆，獲得轉基因植株。主要研究結果如下:
　　1.采用同源克隆法結合RT-PCR從南瓜砧木品種‘帝王新土佐，（Cucurbita maxima×C.moschata

2、cv.Shintosa Supreme）葉片中克隆出△1-吡咯啉-5-羧酸合成酶基因的編碼區(qū)序列，長度為2，154bp，編碼717個氨基酸，命名為CmP5CS(GenBank登錄號:JN606859)。與甜瓜P5CS核苷酸序列相似性為92.34％,該基因具有高等植物P5CS蛋白共有的結構域與結合位點:ATP結合位點、2個亮氨酸結構域、NADPH結合位點、谷氨酰激酶(GK)結構域和谷氨酸半醛(GSA)結構域。
　　2.利用點突變和重

3、疊延伸PCR技術改變CmP5CS序列中特定位置堿基，消除目的基因內部SacⅠ和XbaⅠ的酶切識別位點，將酶切及測序結果正確的CmP5CS基因定向插入到植物雙元表達載體pCMBIA3301的CaMV35啟動子和NOS終止子中間，即成功構建了CmP5CS基因抗除草劑植物表達載體pCMBIA3301-CmP5CSm，用凍融法將其轉入農桿菌LBA4404。
　　3.比較了品種、基本培養(yǎng)基種類、植物生長調節(jié)物質配比等因素對菜用大豆子葉節(jié)不定

4、芽再生率的影響。在B5+1mg·L-1TDZ+0.05mg·L-1NAA+5mg·L-1AgNO3的培養(yǎng)基上，6個菜用大豆品種的不定芽誘導率在53.5％到88.9％之間，其中‘理想95-1’，‘綠領1號’、‘綠領3號’的不定芽再生頻率分別達到88.9％，87.5％和83.3％，建立了菜用大豆高效不定芽再生技術體系。
　　4.探討了基因型、共培養(yǎng)條件和選擇壓等因素對菜用大豆子葉節(jié)遺傳轉化效率的影響。結果表明，農桿菌侵染后，菜用大豆材

5、料‘NY-1001’的GUS瞬時表達率顯著高于其它15個品種。共培養(yǎng)基pH值為5.4，L-半胱氨酸(L-Cys)和乙酰丁香酮(AS)濃度分別為3mM和200μM時，‘NY-1001’的GUS瞬時表達率最高，三因素對該材料轉化效率影響的主次順序為:L-Cys＞pH值＞AS。共培養(yǎng)結束一周后加入篩選劑bialaphos，選擇壓力確定為4mg·L-1?？剐匝哭D入含有0.5mg·L-1GA3的伸長培養(yǎng)基中誘導芽伸長，在含有1mg·L-1IBA的