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文檔簡介
1、菜用大豆[Glycine max(L.)Mer.]營養(yǎng)價值高,深受消費者青睞。隨著市場需求的擴大,其栽培面積正迅速增加。而土壤鹽漬化和次生鹽漬化的日益加劇,使菜用大豆的產(chǎn)量和品質(zhì)受到嚴重影響。本研究從耐鹽南瓜砧木品種中克隆了脯氨酸合成酶基因CmP5CS,并遺傳轉(zhuǎn)化菜用大豆,獲得轉(zhuǎn)基因植株。主要研究結(jié)果如下:
1.采用同源克隆法結(jié)合RT-PCR從南瓜砧木品種‘帝王新土佐,(Cucurbita maxima×C.moschata
2、cv.Shintosa Supreme)葉片中克隆出△1-吡咯啉-5-羧酸合成酶基因的編碼區(qū)序列,長度為2,154bp,編碼717個氨基酸,命名為CmP5CS(GenBank登錄號:JN606859)。與甜瓜P5CS核苷酸序列相似性為92.34%,該基因具有高等植物P5CS蛋白共有的結(jié)構(gòu)域與結(jié)合位點:ATP結(jié)合位點、2個亮氨酸結(jié)構(gòu)域、NADPH結(jié)合位點、谷氨酰激酶(GK)結(jié)構(gòu)域和谷氨酸半醛(GSA)結(jié)構(gòu)域。
2.利用點突變和重
3、疊延伸PCR技術(shù)改變CmP5CS序列中特定位置堿基,消除目的基因內(nèi)部SacⅠ和XbaⅠ的酶切識別位點,將酶切及測序結(jié)果正確的CmP5CS基因定向插入到植物雙元表達載體pCMBIA3301的CaMV35啟動子和NOS終止子中間,即成功構(gòu)建了CmP5CS基因抗除草劑植物表達載體pCMBIA3301-CmP5CSm,用凍融法將其轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌LBA4404。
3.比較了品種、基本培養(yǎng)基種類、植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)配比等因素對菜用大豆子葉節(jié)不定
4、芽再生率的影響。在B5+1mg·L-1TDZ+0.05mg·L-1NAA+5mg·L-1AgNO3的培養(yǎng)基上,6個菜用大豆品種的不定芽誘導率在53.5%到88.9%之間,其中‘理想95-1’,‘綠領(lǐng)1號’、‘綠領(lǐng)3號’的不定芽再生頻率分別達到88.9%,87.5%和83.3%,建立了菜用大豆高效不定芽再生技術(shù)體系。
4.探討了基因型、共培養(yǎng)條件和選擇壓等因素對菜用大豆子葉節(jié)遺傳轉(zhuǎn)化效率的影響。結(jié)果表明,農(nóng)桿菌侵染后,菜用大豆材
5、料‘NY-1001’的GUS瞬時表達率顯著高于其它15個品種。共培養(yǎng)基pH值為5.4,L-半胱氨酸(L-Cys)和乙酰丁香酮(AS)濃度分別為3mM和200μM時,‘NY-1001’的GUS瞬時表達率最高,三因素對該材料轉(zhuǎn)化效率影響的主次順序為:L-Cys>pH值>AS。共培養(yǎng)結(jié)束一周后加入篩選劑bialaphos,選擇壓力確定為4mg·L-1??剐匝哭D(zhuǎn)入含有0.5mg·L-1GA3的伸長培養(yǎng)基中誘導芽伸長,在含有1mg·L-1IBA的
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