褶紋冠蚌谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶和谷胱甘肽過氧化物酶基因的分子克隆、表達(dá)及功能鑒定.pdf

1、學(xué)位論文獨(dú)創(chuàng)性聲明學(xué)位論文獨(dú)創(chuàng)性聲明本人聲明所呈交的學(xué)位論文是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。據(jù)我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得直昌太堂或其他教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書而使用過的材料。與我一同工作的同志對本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說明并表示謝意。一瑚噸棟黼期：卅占月步日學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書本學(xué)位論文作者完全了解直昌太堂有關(guān)保留、使用學(xué)位論

2、文的規(guī)定，有權(quán)保留并向國家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和磁盤，允許論文被查閱和借閱。本人授權(quán)直昌太堂可以將學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編本學(xué)位論文。同時(shí)授權(quán)中國科學(xué)技術(shù)信息研究所將本學(xué)位論文收錄到《中國學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫》，并通過網(wǎng)絡(luò)向社會公眾提供信息服務(wù)。(保密的學(xué)位論文在解密后適用本授權(quán)書)學(xué)位論文作者簽名(手寫)：叩加彖簽字日期：沙ff年占月J歹日導(dǎo)師簽名(手寫)：簽

3、字日期：加tf年彭月叢咱荊螋螋。Y1942993褶紋冠蚌(C脅姍勵(lì)∥砒砌)作為我國重要的淡水育珠蚌之一，易受病原體感染而發(fā)生疾病，育珠能力產(chǎn)生了較大的影響，因此開展其分子免疫的研究具有重要意義。谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(glutathioneS—tr勰sferase，GSTS)是解毒系統(tǒng)中的JI相解毒酶，催化谷胱甘肽親電子底物的附著，在保護(hù)機(jī)體免受自由基(ROS)毒害中起重要作用。利用RACEPCR及同源克隆方法，克隆出褶紋冠蚌GSTcDNA全

4、長。通過與其他物種氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)，這個(gè)GST屬于Pi型，具有谷胱甘肽結(jié)合位點(diǎn)(G位點(diǎn))和外源底物結(jié)合位點(diǎn)(H位點(diǎn))的高度保守序列。褶紋冠蚌piGSTcDNA全長816bp，包括615bp的開放閱讀框編碼205個(gè)氨基酸，5’端非編碼區(qū)19bp，3’端非編碼區(qū)182bp含加尾信號(AATAAA)及ployA尾。預(yù)測編碼的蛋白分子量大小為234kD，等電點(diǎn)為52。褶紋冠蚌piGSTmRNA在血細(xì)胞、鰓、肝臟、閉殼肌和外套膜等組織中均大量表

5、達(dá)，在肝臟中表達(dá)量最大。利用RTPCR分析檢測CppiGST基因在注射嗜水氣單胞菌后048小時(shí)的表達(dá)，結(jié)果表明經(jīng)注射嗜～水氣單胞菌后，各組織中CppiGST基因的表達(dá)增加，到12h后達(dá)到最大值，隨后表達(dá)下降，至48h后恢復(fù)至原有水平。本文還將基因擴(kuò)增產(chǎn)物和表達(dá)載體pET30a及pET32a經(jīng)蜃≯”I、＆DRJ雙酶切之后，連接并構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌Rosettagami(DE3)中，加IPTG至終濃度濃度為1mmol／

6、L，20℃誘導(dǎo)8h，得到大量可溶性蛋白，用Ni2親和層析鎳柱純化。與pET30構(gòu)建的重組質(zhì)粒，其純化蛋白的活性為2396pmoL／min／mg，而與pET32構(gòu)建的重組質(zhì)粒，其純化蛋白的活性為1706pmoL／miIl／mg；重組質(zhì)粒Cp—piGST的最適pH為80左右，最適溫度為37℃左右，隨著變性劑濃度的增加，重組質(zhì)粒CppiGST的活性逐漸降低。谷胱甘肽過氧化物酶(Gluta_thioneperoxidase，GPX)是抗氧化系統(tǒng)