昆蟲桿狀病毒經口感染因子間的相互作用及P74與宿主中腸互作蛋白的研究.pdf

1、昆蟲桿狀病毒在生活周期中會產生兩種表型不同但遺傳物質相同的病毒，即出芽型病毒(Budded virus，BV)和包涵體衍生型病毒(Occlusion-derived virus,ODV)。ODV包裹在包涵體中，被幼蟲食下后通過感染中腸上皮細胞感染宿主幼蟲，這個過程稱為經口感染。多種ODV囊膜蛋白在經口感染中發(fā)揮關鍵作用，它們被稱為經口感染因子(PIFs)。之前研究表明有9種ODV蛋白，包括7種PIFs:P74、PIF1、PIF2、PIF

2、3、PIF4、PIF6、P95(Ac83)和2種ODV特異性蛋白，Ac5和Ac108，可能與ODV表面復合物相關，該復合物被稱為PIF復合物。本研究以桿狀病毒模式種-苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒(Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus，AcMNPV)為研究對象，利用酵母雙雜交和雙分子熒光互補技術探究了與PIF復合物相關的9種蛋白之間相互作用的特點。進一步通過截短和敲除分析了

3、P95和PIF1相互作用的關鍵結構域。此外，作為最早被鑒定到的經口感染因子，P74被發(fā)現(xiàn)與原發(fā)感染中ODV結合中腸上皮細胞相關。為了鑒定宿主中腸細胞中與P74互作的蛋白，構建了家蠶中腸酵母文庫，并以P74作為誘餌進行酵母雙雜交文庫篩選。主要結論如下:
　　1.PIF復合物相關的9種蛋白相互作用的特點。
　　利用酵母雙雜交系統(tǒng)共鑒定到6個相互作用，分別為PIF1-PIF2、PIF1-PIF3、PIF1-PIF4、PIF1-P9

4、5、PIF2-PIF3和PIF3-PIF4，其中PIF1-PIF3、PIF2-PIF3、PIF1-P95為強相互作用，其他的為中等強度相互作用。P74、PIF6、Ac5和Ac108沒有鑒定到參與相互作用。
　　和Y2H結果一致，BiFC分析結果表明復合物中相互作用包括PIF1-PIF2、PIF1-PIF3、PIF1-PIF4、PIF1-P95、PIF2-PIF3和PIF3-PIF4，而其他組合沒有檢測到相互作用。根據(jù)這些結果推測P

5、IF1是PIF復合物的中心，其他成分都和PIF1存在相互作用。
　　2.P95和PIF1相互作用的深入分析
　　分別對PIF1和P95進行N端和C端分段截短，然后進行Y2H分析。結果顯示截掉P95的第200-300個氨基酸(aa)會破壞PIF1和P95之間相互作用，敲除結果證明P95幾丁質結合結構域(224-282aa)為PIF1和P95相互作用的關鍵結構域。用相同方法證明PIF1的100-200aa也是PIF1和P95相互

6、作用的關鍵序列。
　　3.P74與家蠶中腸互作蛋白的鑒定
　　提取5齡第3天家蠶幼蟲中腸RNA，構建了家蠶中腸酵母文庫。以P74作為誘餌對文庫進行篩選，共篩選到6種候選蛋白，分別為U3small nucleolar ribonucleoprotein protein IMP3、60S ribosomal protein L5、JAB-MPN domain protein、Actin,cytoplasmic A3、35kDa

7、proteasecysteine、histidine-rich protein1-B和eukaryotic translation initiation factor1A，最后鑒定到3種可能的互作蛋白，分別為JAB-MPN domain protein、Actin，cytoplasmic A3、35kDa protease。免疫共沉淀結果進一步表明JAB-MPN domain protein和P74之間存在強烈互作，這個蛋白可能是ODV