信號(hào)蛋白TOR與桿狀病毒感染和昆蟲細(xì)胞凋亡的關(guān)系.pdf

1、雷帕霉素靶蛋白(target of rapamycin，TOR)屬于磷脂酰肌醇激酶的相關(guān)激酶(phosphatidylinositol kinase-related kinase，PIKK)超家族，是一類進(jìn)化上非常保守的蛋白激酶，廣泛存在于各種生物細(xì)胞。信號(hào)蛋白TOR是磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)-Akt信號(hào)通路下游的一個(gè)效應(yīng)蛋白，在細(xì)胞存活中處于核心地位，在多種因素的活化下

2、參與基因轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)翻譯起始、細(xì)胞凋亡等多種生物學(xué)過程。很多病毒在感染過程中可通過調(diào)控宿主細(xì)胞PI3K-Akt-TOR信號(hào)通路來完成病毒的復(fù)制。此外，PI3K-Akt-TOR信號(hào)通路的參與還參與了腫瘤壞死因子(tumornecrosis factor,TNF)、放線菌素D(actinomycin D，ActD)等細(xì)胞外因子誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。
　　 先前本室已表明草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)細(xì)胞Sf9中存

3、在PI3K-Akt信號(hào)通路，且該通路在桿狀病毒感染昆蟲細(xì)胞以及誘導(dǎo)昆蟲細(xì)胞凋亡過程中起著重要作用。為了對(duì)鱗翅目昆蟲細(xì)胞中PI3K-Akt信號(hào)通路進(jìn)行較為完整和全面的研究，本文對(duì)PI3K-Akt信號(hào)通路的下游信號(hào)蛋白TOR在桿狀病毒代表種——苜蓿丫紋夜蛾核多角體病毒(Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus，AcMNPV)感染Sf9細(xì)胞過程中所起的作用進(jìn)行了研究。同時(shí)也對(duì)TO

4、R在Sf9細(xì)胞凋亡過程中所起的作用進(jìn)行了初步的探索。
　　 使用TOR的特異性抑制劑雷帕霉素(rapamycin)處理Sf9細(xì)胞，隨著雷帕霉素濃度的升高，被處理細(xì)胞的增殖率降低，說明雷帕霉素對(duì)Sf9細(xì)胞增殖起到了抑制作用，且此抑制作用為濃度依賴型。此外，RNA干擾(RNA interference)下調(diào)Sf9細(xì)胞中TOR的表達(dá)也能抑制細(xì)胞的增殖。表明Sf9細(xì)胞中存在信號(hào)蛋白TOR。
　　 利用特異性識(shí)別磷酸化TOR的抗體

5、進(jìn)行Western blot分析表明，AcMNPV感染導(dǎo)致Sf9細(xì)胞中磷酸化TOR的水平在1 hpi(hours post-infection)升高，且高水平的磷酸化TOR可持續(xù)到18hpi。結(jié)果表明AcMNPV感染Sf9細(xì)胞能磷酸化激活細(xì)胞中的信號(hào)蛋白TOR。
　　 AcMNPV在Sf9細(xì)胞中的有效增殖需要TOR。在病毒感染細(xì)胞后各時(shí)間點(diǎn)利用雷帕霉素處理細(xì)胞抑制TOR后，芽生型病毒(budded virus)和包涵體(occl

6、usion body)的產(chǎn)量都顯著降低。在2hpi加入雷帕霉素處理細(xì)胞，對(duì)子代病毒產(chǎn)量的影響與感染前加入雷帕霉素的相近，說明雷帕霉素并不影響病毒進(jìn)入細(xì)胞。在8hpi和12hpi加入雷帕霉素對(duì)子代病毒產(chǎn)量的影響逐漸降低。24hpi加入雷帕霉素則不影響子代病毒的復(fù)制。這些結(jié)果表明，病毒進(jìn)入細(xì)胞后的早期復(fù)制過程對(duì)PI3K-Akt-TOR信號(hào)通路的依賴性較強(qiáng)，隨后逐漸減弱，感染24h后病毒不再依靠此信號(hào)通路進(jìn)行增殖。Slot blot和West