與鴨坦布蘇病毒E蛋白相互作用的宿主蛋白的篩選.pdf

1、坦布蘇病毒(Tembusu virus,TMUV)感染是我國(guó)2010年新發(fā)生的一種傳染性疾病，該病以種鴨、蛋鴨產(chǎn)蛋下降、雛鴨癱瘓為特征。TMUV感染可危害多個(gè)品種鴨，包括北京鴨、櫻桃谷鴨、紹興鴨、金定鴨、龍巖鴨和山麻鴨等。依據(jù)發(fā)病日齡的不同，感染鴨群的死亡率為5~30％，發(fā)病率可達(dá)90%以上。目前該病在全國(guó)水禽養(yǎng)殖地區(qū)均有發(fā)病和流行，給我國(guó)養(yǎng)鴨業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。DTMUV是單股正鏈RNA病毒，其基因組編碼3個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白（衣殼蛋白、前

2、膜蛋白、囊膜蛋白）和7個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白（NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5）。其中E蛋白是坦布蘇病毒主要的結(jié)構(gòu)蛋白，在病毒的吸附、穿入、宿主范圍、病毒毒力、病毒與細(xì)胞膜的融合以及病毒粒子在細(xì)胞內(nèi)的包裝過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。此外E蛋白也是重要的抗原分子，包含多個(gè)抗原決定簇，可以通過(guò)誘發(fā)中和抗體產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答。本研究以期發(fā)現(xiàn)與E蛋白相互作用的宿主因子，拓展現(xiàn)有的坦布蘇病毒與宿主相互作用網(wǎng)絡(luò)，為闡述坦布蘇病毒的的致

3、病機(jī)制，提出新的疾病防控思路提供理論依據(jù)。本研究包括以下兩個(gè)部分：
　　1.鴨胚成纖維細(xì)胞cDNA文庫(kù)的構(gòu)建
　　取10日齡SPF鴨胚，制備鴨胚成纖維細(xì)胞（DEF)。收集第2代鴨胚成纖維細(xì)胞，采用Trizol法提取鴨胚成纖維細(xì)胞總RNA。以總RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。通過(guò)LD-PCR技術(shù)合成雙鏈cDNA，經(jīng)CHROMA SPIN TE-400 column純化去除小分子雙鏈cDNA后，將純化的雙鏈cDNA與pG

4、ADT7載體連接形成重組質(zhì)粒。利用同源重組的方法將構(gòu)建的重組質(zhì)?？寺〉結(jié)187酵母感受態(tài)細(xì)胞，構(gòu)建了鴨胚成纖維細(xì)胞的cDNA文庫(kù)，并對(duì)構(gòu)建的cDNA文庫(kù)進(jìn)行鑒定。結(jié)果，構(gòu)建的文庫(kù)滴度為3×107 cfu/mL，文庫(kù)插入的雙鏈cDNA片段大小為500~2250 bp，平均大小約為1.0 kb，符合酵母雙雜交篩選的要求。
　　2.與DTMUV E蛋白相互作用的宿主蛋白的篩選
　　采用Trizol法提取DTMUV RNA，RT-P

5、CR方法擴(kuò)增E基因，將E基因與載體pGBKT7分別進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物連接后轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，通過(guò)抗性篩選獲得陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切鑒定并測(cè)序。將構(gòu)建的誘餌質(zhì)粒pGBKT7-E和空載體pGBKT7分別轉(zhuǎn)化Y2H感受態(tài)細(xì)胞，觀察其在SD/-Trp平板上的生長(zhǎng)情況；將誘餌質(zhì)粒pGBKT7-E轉(zhuǎn)化Y2H感受態(tài)細(xì)胞，觀察其在SD/-Trp、SD/-Trp/X-α-Gal/AbA平板上的生長(zhǎng)情況及菌落顏色的變化。利用pGBK

6、T7-E誘餌質(zhì)粒對(duì)鴨胚成纖維細(xì)胞cDNA文庫(kù)進(jìn)行篩選，得到陽(yáng)性文庫(kù)質(zhì)粒，根據(jù)序列比對(duì)分析結(jié)果。結(jié)果，經(jīng)雙酶切鑒定和測(cè)序分析，確定誘餌質(zhì)粒pGBKT7-E構(gòu)建成功；誘餌質(zhì)粒pGBKT7-E在SD/-Trp、SD/-Trp/X-α-Gal/AbA平板上不能生長(zhǎng)，且在SD/-Trp平板上的生長(zhǎng)情況與空載體pGBKT7并無(wú)太大區(qū)別，驗(yàn)證了誘餌質(zhì)粒pGBKT7-E無(wú)自激活活性和毒性；通過(guò)酵母雙雜交從鴨胚成纖維細(xì)胞cDNA文庫(kù)中篩選得到了ANTX1