化學(xué)發(fā)光成像分析的研究.pdf

1、化學(xué)發(fā)光(Chemiluminescence，CL)析因其具有儀器設(shè)備簡單、檢出限低和線性范圍寬等優(yōu)點(diǎn)，已被應(yīng)用于環(huán)境科學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、藥學(xué)、生命科學(xué)、材料科學(xué)等領(lǐng)域．伴隨著CL分析的發(fā)展，CL信號的檢測技術(shù)取得明顯進(jìn)步，既可以利用傳統(tǒng)的光電倍增管(photomultiplier, PMT)檢測CL信號，也可以利用具有高靈敏度、高分辨率的CL成像裝置檢測發(fā)光信號，利用CL成像技術(shù)可對低至單光子水平的光進(jìn)行定位及定量檢測。當(dāng)發(fā)光信號的空間分

2、布體現(xiàn)了重要的分析信息時(shí)，成像檢測技術(shù)更有優(yōu)勢。 本論文的研究工作主要由化學(xué)發(fā)光陣列成像平臺的建立；化學(xué)發(fā)光免疫成像分析和自發(fā)電池激發(fā)的電化學(xué)發(fā)光成像分析三大部分構(gòu)成。 1.化學(xué)發(fā)光陣列成像平臺的建立CL成像分析主要包括微孔版、微陣列及微型化裝置中的定量檢測：基于酶、免疫組織化學(xué)和原位雜交反應(yīng)的顯微成像分析；生物體的發(fā)光成像分析等。然而，CL成像不同于熒光成像，在進(jìn)行熒光成像時(shí)，在一定波長光的激發(fā)下，產(chǎn)生穩(wěn)定的光信號，光

3、信號不隨時(shí)間而變化，我們可在任一段時(shí)間內(nèi)積分，獲得熒光強(qiáng)度，然而，CL信號是時(shí)間的函數(shù)，CL強(qiáng)度隨時(shí)間而改變。大多數(shù)CL反應(yīng)是快反應(yīng)，發(fā)光在數(shù)秒內(nèi)便完成，因?yàn)榉磻?yīng)的引發(fā)與數(shù)據(jù)采集間存在延遲時(shí)間，利用傳統(tǒng)的的CL成像方法不能檢測這樣的快反應(yīng)。因而現(xiàn)有的CL成像分析只能夠檢測一些慢CL反應(yīng)，或者將快發(fā)光反應(yīng)轉(zhuǎn)化為慢發(fā)光反應(yīng)才能進(jìn)行成像。例如辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)催化的魯米諾與H<,2>O<,.

4、2>間的CL反應(yīng)是快發(fā)光反應(yīng)，不適合成像分析，通常要加入對碘苯酚等增強(qiáng)劑增強(qiáng)發(fā)光強(qiáng)度并延長發(fā)光時(shí)間。然而，很難將多數(shù)快CL反應(yīng)轉(zhuǎn)變?yōu)槁磻?yīng)。即使將一些慢發(fā)光反應(yīng)用于成像分析，最大發(fā)光強(qiáng)度仍然不能被CCD捕獲到。例如，加入增強(qiáng)劑的魯米諾/H<,2>O<,2>/HRP體系，在幾十秒內(nèi)，發(fā)光強(qiáng)度迅速增加并達(dá)到最大值，隨后緩慢的降到與背景值相當(dāng)?shù)臄?shù)值。然而，在幾十秒內(nèi)，操作者很難將所有CL試劑手動(dòng)地加入到96孔、384孔酶標(biāo)板或微陣列系統(tǒng)中，C

5、L反應(yīng)過程的信號不能全部被記錄下來，在已開始反應(yīng)的孔中，最大發(fā)光信號將被錯(cuò)過。這將導(dǎo)致檢測發(fā)光信號的靈敏度相對較差。并且，如果采用手動(dòng)加樣方式將CL試劑加到微孔板或微陣列中，由于CL反應(yīng)不能在同一時(shí)間被引發(fā)，將導(dǎo)致CL信號的重現(xiàn)性較差。即使采用自動(dòng)加樣系統(tǒng)，反應(yīng)的引發(fā)及信號采集之間的延遲時(shí)間仍然存在，這是傳統(tǒng)CL成像方法存在的問題. 我們利用魯米諾/血紅蛋白/對碘苯酚CL反應(yīng)體系作為模型，建立了一種新的在線調(diào)控的CL陣列成像平臺，解決上

6、述問題。眾所周知，在堿性介質(zhì)中，魯米諾能產(chǎn)生很強(qiáng)的CL信號，而在酸性條件下，不能產(chǎn)生CL信號。所以，我們設(shè)想可以通過控制反應(yīng)的pH值引發(fā)并控制CL反應(yīng)．最終的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明利用本方法提高了檢測的靈敏度。這種反應(yīng)可控的CL成像分析平臺的建立，將使快CL反應(yīng)的成像檢測成為可能. 反應(yīng)可控的化學(xué)發(fā)光成像分析的設(shè)計(jì)及應(yīng)用設(shè)計(jì)了反應(yīng)可控的CL成像分析方法。本方法通過控制反應(yīng)的pH值引發(fā)CL反應(yīng)，并獲得了很高的靈敏度。反應(yīng)盼pH值由在線產(chǎn)生的

7、氨氣調(diào)節(jié)，氨氣由NaOH溶液與NH<,4>CI溶液反應(yīng)產(chǎn)生，氨氣的量可以通過改變NaOH溶液的濃度，進(jìn)樣時(shí)間及流速來調(diào)節(jié)，也可以通過改變NH<,4>Cl溶液的濃度來控制。96孔酶標(biāo)板各孔中的CL試劑吸收氨氣后，pH值從相同的起始值持續(xù)增加，相對CL強(qiáng)度隨pH值增加而增加?；谝陨系脑O(shè)計(jì)，96孔酶標(biāo)板上的CL反應(yīng)在同一時(shí)間被引發(fā)，每孔中整個(gè)CL反應(yīng)過程的信號可以被記錄下來。從而獲得高的靈敏度及良好的重現(xiàn)性。試驗(yàn)了魯米諾/H<,2>O<,2

8、>CL體系，用于測定血紅蛋白(Hb))。CL強(qiáng)度與Hb濃度在1.0×10<'-9>～1.0×10<'-7>mol/L范圍內(nèi)呈線性，檢出限為3.0×10<'-10> mol/L(3s)，對1.0×10<'-8> mol/L的Hb進(jìn)行11次平行測定，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(R.S.D.)為2.7％。 2.化學(xué)發(fā)光免疫成像分析本論文的第二部分的研究工作主要由兩部分內(nèi)容構(gòu)成：基于魯米諾增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(ECL)體系的免疫成像分析和基于草酰酯CL反應(yīng)的

9、免疫成像分析。并應(yīng)用到重組人腫瘤壞死因子a(rh TNF-a)，金黃色葡萄球菌腸毒素C<,1>(sEC<,1>)，白介素6(rHuIL-6)和β-人絨毛膜促性腺激素(B-HCG)的檢測。 (1)化學(xué)發(fā)光成像分析法檢測人血清中的腫瘤壞死因子α 設(shè)計(jì)了一種簡單、靈敏、高通量的分析方法用于重組人腫瘤壞死因子(recombinant human tumor necrosis factor-a，rh TNF-a)的檢測。本法具有酶

10、聯(lián)免疫吸附(enzymc-linked immuaosorbcnt assays，ELISA)法的特異性、增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECL)的高靈敏度及CL成像分析高樣品通量等優(yōu)點(diǎn)。透明的96孔板被用做固相載體?；贓LISA分析法中雙抗體夾心法的原理，將對rh TNF-a抗原具有特異結(jié)合能力的一種抗體作為包被抗體，另一被辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的抗體作為酶標(biāo)抗體。一臺帶有低溫冷卻裝置的CCD成像系統(tǒng)被用于檢測CL信號。CL強(qiáng)度值與rh TN

11、F-a濃度在9.0-312.0 pg/mL范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，檢出限為1 pg/mL(3s)。本法已被成功地用于人血清中的rh TNF-a的檢測，對78.0 pg/mL rh TNF-a 8次平行測定結(jié)果的R.S.D.為4.7％，利用標(biāo)準(zhǔn)加入法所得回收率結(jié)果為94.0～108.2％，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本方法具有實(shí)際應(yīng)用的可行性。 (2)化學(xué)發(fā)光免疫成像分析法測定牛奶和水中的金黃色葡萄球菌腸毒素C<,1>設(shè)計(jì)了一種靈敏、簡單、快速及高

12、通量的方法測定金黃色葡萄球菌腸毒素C<,1>(staphylococcal enmromxin C，SEC，本方法具有ELISA法的特異性，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光分析法(ECL)的高靈敏度，及成像分析法高通量檢測的優(yōu)勢?；陔p抗體夾心法的免疫反應(yīng)原理，以96孔酶標(biāo)板作為固定化載體。用一臺商品化的帶有低溫冷卻裝置的CCD成像系統(tǒng)檢測CL信號。在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，發(fā)光強(qiáng)度值與SECl濃度在8.0～125.0ng/mL范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系(r<'2>=9

13、976)，檢出限為0.5 ng/mL(3s)，對25.0 nE/ml SECl8次測定結(jié)果的R.S.D.為6.0％。將本方法用于檢測牛奶和水中SEC<,1>含量，測定結(jié)果與ELISA法相吻合。 (3)以納米金為載體的化學(xué)發(fā)光免疫成像分析的研究及應(yīng)用以微孔板為載體的EUsA分析因其具有的高靈敏度和好的特異性被廣泛應(yīng)用于免疫分析。聚苯乙烯因其具有光學(xué)透明性并且表面性質(zhì)可改變，成為應(yīng)用最為廣泛的固定相載體。未修飾的聚苯乙烯表面帶有長的

14、碳?xì)滏?，會排斥水及親水性分子，吸引疏水性分子。大的親水性分子一般都帶有疏水鏈，會使分子吸附在聚苯乙烯表面。但需要很長的孵育時(shí)間、較高的物質(zhì)分子濃度和嚴(yán)格的控制溫度等條件，以防止物質(zhì)分子從聚苯乙烯表面被洗脫下來。因此，亟需建立更好的的固定化方法以滿足免疫分析的需求。納米金因其比表面積大、生物兼容性好及表面自由能高，已在生物試劑的固定化及免疫分析等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。 本文設(shè)計(jì)了一種以納米金為載體固定蛋白質(zhì)的新方法。納米金和蛋白質(zhì)形成

15、的生物復(fù)合材料被成功地固定在聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)片和聚苯乙烯微孔板上。蛋白質(zhì)可被高密度地固定在固相載體上并較好地保留生物活性?；谝陨显O(shè)計(jì)，建立了利用CL成像檢測H<,2>O<,2>及重組人白介素-6(rHu IL-6)的分析方法。 3.自發(fā)電池激發(fā)的電化學(xué)發(fā)光成像分析電化學(xué)發(fā)光(Electrogenerated chemiluminescence，ECL)也稱電致化學(xué)發(fā)光，是電化學(xué)反應(yīng)過程中產(chǎn)生的激發(fā)態(tài)分子返回基態(tài)產(chǎn)生

16、的光輻射，已成為分析化學(xué)中重要且有價(jià)值的檢測方法．目前，文獻(xiàn)報(bào)道的ECL分析都是使用外加的電源來實(shí)現(xiàn)ECL的激發(fā)，這就限制了ECI檢測系統(tǒng)的微型化，及其在微全分析系統(tǒng)中的進(jìn)一步應(yīng)用。我們設(shè)想能否不使用任何外加電源便可實(shí)現(xiàn)ECL的激發(fā)?我們曾經(jīng)設(shè)計(jì)了微型自發(fā)原電池為魯米諾體系及鈣黃綠素的電化學(xué)發(fā)光提供激發(fā)電位。大大的簡化了ECL的設(shè)備，在ECL系統(tǒng)的微型化方面，邁出了新的步伐。金屬Al，Zu，Cr，Cd等可作為陽極，Ca，Ag，Au，Pt

17、及石墨等可作為電池的陰極。最后選擇Al作為自發(fā)原電池的陽極，Ag作為陰極?？赏ㄟ^改變流動(dòng)試劑的組成或用其他金屬替換Al和Ag電極對調(diào)節(jié)電池的電位。在后續(xù)的工作中，進(jìn)一步研究了Cu/Zn,合金形成的自發(fā)原電池。Cu/Zn合金自發(fā)原電池可以為魯米諾電化學(xué)發(fā)光提供穩(wěn)定的電位，將Cu/Zn合金顆粒單獨(dú)置于96孔板中形成自發(fā)電池傳感器陣列，并利用魯米諾/H<,2>O<,2>CL體系驗(yàn)證傳感器的性能。自發(fā)電池傳感器陣列具備以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)：首先，不需要