糖基化終末產(chǎn)物對人角膜上皮細胞凋亡的影響.pdf

1、研究目的:角膜上皮創(chuàng)傷愈合延遲是目前眼科臨床常見的糖尿病眼部并發(fā)癥之一，治療棘手，發(fā)生機制尚不清楚。糖基化終末產(chǎn)物(advancedglycationendproducts，AGEs)是在持續(xù)高糖條件下，蛋白質的氨基與糖的醛基在非酶催化反應下生成的終產(chǎn)物，與糖尿病慢性并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展相關。AGEs促進ROS的生成，而ROS可通過不同的途徑誘導細胞凋亡。因此本課題通過研究AGEs對THCEs凋亡作用及其與ROS的關系，探討AGEs在糖尿病

2、角膜創(chuàng)傷愈合延遲中的作用機制。
　　 研究方法:利用牛血清白蛋白(BSA)和葡萄糖體外制備AGE-BSA及其對照物。體外培養(yǎng)THCE細胞與不同濃度（50μg/ml，100μg/ml，200μg/ml，400μg/ml）的AGEs修飾牛血清白蛋白(AGE-BSA)在體外共同培養(yǎng)不同時間(6h，12h，24h，48h)。應用Annexin(V)-Fitc和碘化丙啶(PI)與細胞共同孵育，通過流式細胞儀檢測并定量分析細胞凋亡百分率;采

3、用Westemblot檢測凋亡蛋白Bcl-2，Bax蛋白表達。選用刺激效果最好的AGE-BSA濃度和作用時間，抗氧化劑NAC(20μmol/L)預先作用1小時清除內(nèi)源性ROS或NADPH氧化酶抑制劑DPI(10μM)和Apocynin（300μM）孵育1小時抑制NADPH氧化酶后，實驗分為9組:空白對照組、BSA對照組、AGE-BSA組、AGE-BSA+NAC組、AGE-BSA+DPI組、AGE-BSA+Apocynin組、DPI組、A

4、pocynin組、NAC組，應用流式細胞儀檢測細胞凋亡百分率。選用刺激效果最好的AGE-BSA濃度和作用時間，用NADPH氧化酶抑制劑DPI(10μM)和Apocynin（300μM）抑制NADPH氧化酶后，實驗分為5組，分別為空白對照組、BSA對照組、AGE-BSA組、AGE-BSA+DPI組、AGE-BSA+Apocynin組，用Westemblot檢測Bax蛋白表達。
　　 結果:流式細胞儀凋亡檢測分析THCEs凋亡率結果

5、顯示:200μg/mlAGE-BSA刺激細胞6h，凋亡細胞明顯增加(P＜0.05)，24h達高峰(P＜0.05)，與對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義;BSA對照組與空白對照組相比凋亡率改變無統(tǒng)計學意義。50μg/mlAGE-BSA能夠明顯刺激THCE細胞凋亡(P＜0.05)，100μg/ml，200μg/ml和400μg/mlAGE-BSA均能夠顯著增加角膜上皮細胞凋亡(P＜0.05)，與對照組比差異有統(tǒng)計學意義;BSA對照組與空白對照組相

6、比凋亡率改變無統(tǒng)計學意義。Western-blot結果顯示:200ug/mlAGE-BSA刺激THCE細胞6h，12h，24h，Bax蛋白表達增強，12h達高峰(P＜0.05);Bcl-2蛋白表達減弱，24h最明顯(P＜0.05)。分別用ROS清除劑NAC清除ROS，NADPH氧化酶抑制劑DPI、Apocynin抑制NADPH氧化酶從而抑制細胞內(nèi)ROS的生成后，AGE-BSA200ug/ml刺激THCE細胞24h，流式結果顯示，與AGE

7、-BSA組相比，流式細胞儀檢測細胞凋亡率均明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);與空白對照組及BSA對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義。應用NADPH氧化酶抑制劑DPI、Apocynin抑制NADPH氧化酶從而抑制細胞內(nèi)ROS的生成后，AGE-BSA200ug/ml刺激THCE細胞24h，Westernblot檢測Bax蛋白表達降低，與AGE-BSA組相比差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);與空白對照組及BSA對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義