氫氣抗糖基化終末產物對內皮細胞凋亡的影響及機制研究.pdf

1、背景與研究目的：
　　糖尿病是一種常見的代謝性疾病,主要表現為機體胰島素相對或者絕對不足,導致血糖水平持續(xù)性增高。目前全球2型糖尿病患者已超過1.5億人,而且預計在未來20年內病例數還將成倍數增長態(tài)勢,全球醫(yī)療負擔也會因為這一數值的顯著提高而明顯增加[1]。不論是1型還是2型糖尿病,隨著長期高血糖水平病程的逐漸進展,均可以造成不同程度的,不同靶器官的并發(fā)癥,其中以心血管病變最為常見,也最具威脅性。
　　血管并發(fā)癥是導致糖尿病

2、患者死亡的主要原因。其中,高血壓,肥胖癥,動脈粥樣硬化,血脂代謝異常,糖尿病腎病亦是患者預后不良的重要危險因素。在糖尿病的發(fā)生發(fā)展過程當中,血管內皮的損傷和內皮功能障礙是糖尿病重要的早期病理表現。從細胞層面來講,內皮細胞代謝異常則是早期內皮功能受損的基本原因,伴隨著內皮細胞的不斷凋亡和功能受損,隨之而來的則是內皮功能障礙[2.3]。
　　晚期糖基化終末產物(AGEs)是以體內大分子物質如脂肪,蛋白質,核酸和還原性糖(葡萄糖,果糖,

3、戊糖)為原料,在生理環(huán)境中通過發(fā)生非酶促反應,生成的穩(wěn)定共價鍵產物。這種非酶促反應稱之為---Maillard(美拉德)。1953年Hodge等學者提出了美拉德反應,該反應主要包括如下三部分:1.初級反應階段。還原糖的羰基與氨基之間進行加成,加成物迅速失去分子水轉變?yōu)橄７驂A。2.經環(huán)化形成相應的取代醛基胺,經重排后轉成有反應活性的產物,其中最熟知的是糖基化血紅蛋白和果糖胺。3.果糖胺等又經過一系列復雜的分解和化學重排反應最終形成了AGE

4、s類黑精色素。AGEs一旦形成就是不可逆的,并且其具有較強的交聯性和較低的溶解性。此外,AGEs還具有產生和激活ROS的能力[61],這些特點也是其損傷血管的重要理化因素。AGEs的產生和糖尿病患者血糖水平以及高血糖暴露的時間成正相關,患者血糖水平越高,暴露高血糖的時間越久,AGEs的產生和堆積就越多。此外,局部微環(huán)境的氧化應激也是加速AGEs形成的重要因素之一[62.63]。在正常機體中,葡萄糖的糖基化反應較低。然而,在糖尿病患者體內

5、,持續(xù)性的高血糖和局部微環(huán)境的氧化應激加速了AGEs產生和堆積。
　　血液循環(huán)中堆積的AGEs可進行性損害血管內皮[65]。國外研究者發(fā)現,胰島素可通過清除AGEs來保護內皮細胞功能,胰島素通過IRS以及PI-3K通路提高機體產生NO的能力,從而提高機體對葡萄糖的轉運和利用,減少AGEs的產生和保護內皮功能。此外,胰島素還可以提高內皮細胞清道夫受體的含量,從而加速AGEs的清除。另外,蓄積在體內的AGEs低密度脂蛋白(LDL)可以

6、形成AGEs-LDL共價化合物,形成AGEs-LDL后,LDL在體內的循環(huán)清除受阻,LDL在循環(huán)中的比例升高,致體內脂質水平明顯增加,加重內皮氧化損傷。此外,血管內皮的基質成分含有膠原蛋白,它們與循環(huán)中的還原性糖發(fā)生共價結合以后可以使膠原蛋白交聯,從而使血管內皮內環(huán)境受到破壞。同時,血管內皮的AGEs還能夠激活單核巨噬系統(tǒng),使得它們在對AGEs發(fā)生吞噬作用的同時分泌大量的細胞因子,刺激血管內皮發(fā)生氧化,應激,變形,增生,增殖,凋亡等一系

7、列病理反應,惡化內皮功能,最終導致動脈粥樣硬化,甚至血管完全閉塞。在糖尿病患者當中,持續(xù)升高的血糖狀態(tài)極易導致AGEs的過量產生[4]。我們課題組的前期研究也發(fā)現,AGEs可以加快血管內皮細胞的凋亡和內皮功能不全的病理進程;在AGEs誘導的細胞當中,其細胞間活性氧(ROS)水平較對照組是明顯升高的,而且同時,這種升高的細胞間ROS水平反過來進一步刺激AGEs的不斷生成,形成“氧化應激-AGEs”的惡性循環(huán)[6.7]。
　　因此,如

8、何清除AGEs或減少這些AGEs的產生似乎可以成為減少糖尿病并發(fā)癥的治療策略之一。但是,AGEs一旦在血管內皮生成共價鍵,其就如一團黏著的基團,很難清除。那么,如果能夠拮抗由AGEs介導的血管內皮功能損傷,則理論上也能預防或者延緩血管內皮損傷-動脈粥樣硬化的進程[8]。所以,探尋一種拮抗AGEs介導的內皮細胞氧化應激以及凋亡的治療策略有望成為防治糖尿病并發(fā)癥的潛在切入點。
　　傳統(tǒng)的抗氧化應激的制劑包括維生素C,維生素E,β胡蘿卜

9、素,超氧化物歧化酶等。由于結構和效價關系的限制,這些天然抗氧化劑的抗氧化作用較弱且作用可逆,組織穿透能力差,而且其循證學研究的結果多為陰性。另外,在已經發(fā)生氧化應激反應的細胞當中多半有代謝和功能障礙,其自身合成分泌抗氧劑的能力差。為此,尋求一種新型的,有效的,安全的,穿透力強,靶向性高的抗氧劑是拮抗機體氧化應激反應延緩動脈粥樣硬化的潛在突破口之一。
　　氫氣是一種無色,無味,無臭具有一定還原性的易燃氣體。過去許多學者認為氫氣是一種

10、生理性惰性氣體,不會與機體生命物質發(fā)生生理生化反應。但也有極少數的科學家認為氫氣是一種具有還原性的氣體。發(fā)表在1975年《Science》雜志上的一篇文章報道,在皮膚鱗狀細胞癌動物模型中,連續(xù)呼吸8個大氣壓97.5％氫氣兩周,可以有效治療鱗狀細胞癌,并且研究者認為其機制可能與氫氣的抗氧化作用有關[9]。之后又有實驗研究發(fā)現,呼吸高壓氫氣能夠治療肝臟寄生蟲感染引起的肝炎,并提出氫氣的抗炎作用機制可能與氫氣和羥自由基反應有關[10]。雖然上

11、述研究為引起學者的廣泛關注,但Ohsawa等2007年發(fā)表在《Nature》上的一篇文章提出,缺血再灌注和炎癥所致的急性氧化應激可以導致嚴重的組織損傷。研究者通過建立大腦缺血再灌注的氧化應激大鼠模型,在非高壓的條件下,應用吸入氫氣作為治療干預,結果發(fā)現氫氣能夠通過抗氧化作用減輕大鼠腦缺血再灌注損傷。文中還討論到,氫氣可能具有選擇性的抗氧化作用,也即氫氣只于與·OH和ONOO-發(fā)生反應,而并不與其它具有生理活性作用的活性氧發(fā)生生物化學反應

12、,如O2-·、H2O2和NO·等。氫氣的這種溫和還原性的優(yōu)點,使得它在抗氧化作用的同時對機體內部必須的生理反應過程影響極小。另外,和生理活性氧O2-·、H2O2和NO·相比,·OH和ONOO-等氧自由基的氧化性明顯高于生理活性氧,而這也使得還原性比較溫和的氫氣只與這些強自由基的發(fā)生中和反應。除了這些特點外,氫氣的高物理擴散性又是其獨特的優(yōu)勢[11]。隨后,日本科學家Hayashida等在Ohsawa等研究的基礎上,在大鼠心肌梗死缺血再灌

13、注模型中證實吸入氫氣能夠有助于心梗再灌注后心功能的恢復,減少心肌梗死面積,并預防心室結構重構。實驗再次證實了氫氣到達治療靶點的高效性和高通透性[12]。2010年,ChenCH等學者在大鼠局灶腦缺血過程中,吸入氫氣2小時能夠降低基質金屬蛋白-9活性并減小腦缺血面積[13]。2012年,中國學者Ge等在大鼠動物模型中發(fā)現吸入氫氣可以減輕短暫腦缺血誘導的認知功能障礙,其可能的機制為氫氣可以拮抗氧化應激作用從而減少神經細胞的死亡[14]。同年

14、,ZhanY學者等在CritCareMed雜志發(fā)表關于吸入氫氣治療的實驗研究成果。他們在130余只硬膜下出血腦損傷的大鼠模型中發(fā)現吸入氫氣2小時可以明顯減輕腦水腫和血腦屏障損傷[15]。同時在分子研究層面證實,氫氣可以減輕大腦脂質,核酸,蛋白質的氧化損傷。正如德國學者Hardeland對該研究的評論,吸入氫氣可能是將來醫(yī)學領域一種頗有前景的治療策略[16]。
　　不僅如此,除了吸入氫氣,科學家們還利用氫氣擴散特點制備成富含氫的溶液

15、并探究其治療作用。最開始是由Sun等學者提出假設富含氫的生理鹽水是否依然具有抗氧化應激作用。他們在大鼠的心梗模型中通過注射富氫生理鹽水的方法對心梗后的大鼠進行干預,結果發(fā)現富氫生理鹽水仍然具有有效抗氧化應激,減少心肌死亡,改善心功能的治療作用[17]。同期還有中國學者們發(fā)現富氫生理鹽水對小腸的缺血再灌注損傷也有保護作用,并同時可以改善小腸的收縮功能[18.20]。另外Chen等在大鼠實驗中發(fā)現,富氫生理鹽水在急性胰腺損傷中能減輕氧化應激

16、,減少胰腺細胞死亡,有意思的是,富氫生理鹽水還能促進胰腺腺泡細胞的增生[21]。因為富氫生理鹽水的制備過程并不復雜,而且有使用方便,便于運輸,實用等特點,一時間將富氫生理鹽水作為治療制劑研究其治療作用的研究迅速成為熱點,相應的研究結果均提示富氫溶液作為醫(yī)療制劑的誘人前景[22.30]。
　　盡管如此,人們對氫的抗氧化作用的具體分子生物學機制還未能深入研究。前面我們提到,AGEs可以誘導血管內皮的氧化應激反應,從而刺激內皮細胞增生,

17、炎癥細胞侵潤,凋亡,內皮功能障礙,血管粥樣硬化的系列病理改變。氫能否通過抑制AGEs誘導的氧化應激,產生內皮保護作用有待實驗進一步證實?；诖?我們課題組設計了“氫氣抗AGEs誘導的內皮凋亡及其機制”這課題,對我們的課題假設進行初步證實。
　　材料和方法：
　　SD大鼠購自于第三軍醫(yī)大學動物室,用于主動脈內皮細胞的原代培養(yǎng)。富含氫氣的培養(yǎng)基被應用于模擬高氫氣的環(huán)境。Real-timePCR和分光光度測定KIT用于抗氧化應激酶

18、SOD和GSH-PH基因和蛋白表達量檢測,DCF-DA作為熒光探針運用流式細胞儀檢測細胞內的活性氧(ROS)水平;AnnexinV-APC凋亡檢測試劑盒和TUNEL染色法被用于內皮細胞凋亡的檢測,蛋白印跡分析(WB)用于檢測Bcl-2(凋亡抑制蛋白)和Bax(凋亡促進蛋白)比率分析于說明內皮細胞凋亡水平。
　　結果：
　　1.AGEs可以誘導內皮細胞凋亡并且呈濃度依賴性,HRM組和正常對照組的細胞凋亡水平無顯著差異。AGEs

19、組細胞凋亡水平明顯高于正常對照組和HRM組,加入HRM能夠明顯抑制AGEs所誘導的細胞凋亡。
　　2.流式細胞儀分析法檢測發(fā)現,加有AGEs的內皮細胞(AGEs組)其細胞間ROS水平較正常對照組明顯升高,且升高的水平成濃度依賴關系。但HRM組細胞ROS水平和正常對照組比較我顯著差異。在AGEs+HRM組中發(fā)現細胞間ROS水平較AGEs組明顯降低,并和正常對照組相似。
　　3.抗氧應激檢測顯示:在mRNA方面,AGEs能顯著降

20、低SODmRNA的表達水平,而且這中降低與AGEs呈濃度相關性。而HRM干預后能夠明顯改善AGEs對SODmRNA表達的抑制作用。另外,在酶活性比較方面,AGEs對內皮細胞SOD和GSH-PX這兩種抗氧化酶的酶活性均成抑制效應,而HRM干預則能改善AGEs的這種不良效應。
　　4.凋亡蛋白水平檢測發(fā)現AGEs組Bcl-2表達量較正常對照組明顯下降,而Bax蛋白表達量較對照組明顯增加,Bcl/Bax蛋白表達量比例在改組明顯下降,提示