氫氣抗糖基化終末產(chǎn)物對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響及機(jī)制研究.pdf

1、背景與研究目的：
　　糖尿病是一種常見的代謝性疾病,主要表現(xiàn)為機(jī)體胰島素相對(duì)或者絕對(duì)不足,導(dǎo)致血糖水平持續(xù)性增高。目前全球2型糖尿病患者已超過1.5億人,而且預(yù)計(jì)在未來20年內(nèi)病例數(shù)還將成倍數(shù)增長態(tài)勢(shì),全球醫(yī)療負(fù)擔(dān)也會(huì)因?yàn)檫@一數(shù)值的顯著提高而明顯增加[1]。不論是1型還是2型糖尿病,隨著長期高血糖水平病程的逐漸進(jìn)展,均可以造成不同程度的,不同靶器官的并發(fā)癥,其中以心血管病變最為常見,也最具威脅性。
　　血管并發(fā)癥是導(dǎo)致糖尿病

2、患者死亡的主要原因。其中,高血壓,肥胖癥,動(dòng)脈粥樣硬化,血脂代謝異常,糖尿病腎病亦是患者預(yù)后不良的重要危險(xiǎn)因素。在糖尿病的發(fā)生發(fā)展過程當(dāng)中,血管內(nèi)皮的損傷和內(nèi)皮功能障礙是糖尿病重要的早期病理表現(xiàn)。從細(xì)胞層面來講,內(nèi)皮細(xì)胞代謝異常則是早期內(nèi)皮功能受損的基本原因,伴隨著內(nèi)皮細(xì)胞的不斷凋亡和功能受損,隨之而來的則是內(nèi)皮功能障礙[2.3]。
　　晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGEs)是以體內(nèi)大分子物質(zhì)如脂肪,蛋白質(zhì),核酸和還原性糖(葡萄糖,果糖,

3、戊糖)為原料,在生理環(huán)境中通過發(fā)生非酶促反應(yīng),生成的穩(wěn)定共價(jià)鍵產(chǎn)物。這種非酶促反應(yīng)稱之為---Maillard(美拉德)。1953年Hodge等學(xué)者提出了美拉德反應(yīng),該反應(yīng)主要包括如下三部分:1.初級(jí)反應(yīng)階段。還原糖的羰基與氨基之間進(jìn)行加成,加成物迅速失去分子水轉(zhuǎn)變?yōu)橄７驂A。2.經(jīng)環(huán)化形成相應(yīng)的取代醛基胺,經(jīng)重排后轉(zhuǎn)成有反應(yīng)活性的產(chǎn)物,其中最熟知的是糖基化血紅蛋白和果糖胺。3.果糖胺等又經(jīng)過一系列復(fù)雜的分解和化學(xué)重排反應(yīng)最終形成了AGE

4、s類黑精色素。AGEs一旦形成就是不可逆的,并且其具有較強(qiáng)的交聯(lián)性和較低的溶解性。此外,AGEs還具有產(chǎn)生和激活ROS的能力[61],這些特點(diǎn)也是其損傷血管的重要理化因素。AGEs的產(chǎn)生和糖尿病患者血糖水平以及高血糖暴露的時(shí)間成正相關(guān),患者血糖水平越高,暴露高血糖的時(shí)間越久,AGEs的產(chǎn)生和堆積就越多。此外,局部微環(huán)境的氧化應(yīng)激也是加速AGEs形成的重要因素之一[62.63]。在正常機(jī)體中,葡萄糖的糖基化反應(yīng)較低。然而,在糖尿病患者體內(nèi)

5、,持續(xù)性的高血糖和局部微環(huán)境的氧化應(yīng)激加速了AGEs產(chǎn)生和堆積。
　　血液循環(huán)中堆積的AGEs可進(jìn)行性損害血管內(nèi)皮[65]。國外研究者發(fā)現(xiàn),胰島素可通過清除AGEs來保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞功能,胰島素通過IRS以及PI-3K通路提高機(jī)體產(chǎn)生NO的能力,從而提高機(jī)體對(duì)葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)和利用,減少AGEs的產(chǎn)生和保護(hù)內(nèi)皮功能。此外,胰島素還可以提高內(nèi)皮細(xì)胞清道夫受體的含量,從而加速AGEs的清除。另外,蓄積在體內(nèi)的AGEs低密度脂蛋白(LDL)可以

6、形成AGEs-LDL共價(jià)化合物,形成AGEs-LDL后,LDL在體內(nèi)的循環(huán)清除受阻,LDL在循環(huán)中的比例升高,致體內(nèi)脂質(zhì)水平明顯增加,加重內(nèi)皮氧化損傷。此外,血管內(nèi)皮的基質(zhì)成分含有膠原蛋白,它們與循環(huán)中的還原性糖發(fā)生共價(jià)結(jié)合以后可以使膠原蛋白交聯(lián),從而使血管內(nèi)皮內(nèi)環(huán)境受到破壞。同時(shí),血管內(nèi)皮的AGEs還能夠激活單核巨噬系統(tǒng),使得它們?cè)趯?duì)AGEs發(fā)生吞噬作用的同時(shí)分泌大量的細(xì)胞因子,刺激血管內(nèi)皮發(fā)生氧化,應(yīng)激,變形,增生,增殖,凋亡等一系

7、列病理反應(yīng),惡化內(nèi)皮功能,最終導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化,甚至血管完全閉塞。在糖尿病患者當(dāng)中,持續(xù)升高的血糖狀態(tài)極易導(dǎo)致AGEs的過量產(chǎn)生[4]。我們課題組的前期研究也發(fā)現(xiàn),AGEs可以加快血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡和內(nèi)皮功能不全的病理進(jìn)程;在AGEs誘導(dǎo)的細(xì)胞當(dāng)中,其細(xì)胞間活性氧(ROS)水平較對(duì)照組是明顯升高的,而且同時(shí),這種升高的細(xì)胞間ROS水平反過來進(jìn)一步刺激AGEs的不斷生成,形成“氧化應(yīng)激-AGEs”的惡性循環(huán)[6.7]。
　　因此,如

8、何清除AGEs或減少這些AGEs的產(chǎn)生似乎可以成為減少糖尿病并發(fā)癥的治療策略之一。但是,AGEs一旦在血管內(nèi)皮生成共價(jià)鍵,其就如一團(tuán)黏著的基團(tuán),很難清除。那么,如果能夠拮抗由AGEs介導(dǎo)的血管內(nèi)皮功能損傷,則理論上也能預(yù)防或者延緩血管內(nèi)皮損傷-動(dòng)脈粥樣硬化的進(jìn)程[8]。所以,探尋一種拮抗AGEs介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激以及凋亡的治療策略有望成為防治糖尿病并發(fā)癥的潛在切入點(diǎn)。
　　傳統(tǒng)的抗氧化應(yīng)激的制劑包括維生素C,維生素E,β胡蘿卜

9、素,超氧化物歧化酶等。由于結(jié)構(gòu)和效價(jià)關(guān)系的限制,這些天然抗氧化劑的抗氧化作用較弱且作用可逆,組織穿透能力差,而且其循證學(xué)研究的結(jié)果多為陰性。另外,在已經(jīng)發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)的細(xì)胞當(dāng)中多半有代謝和功能障礙,其自身合成分泌抗氧劑的能力差。為此,尋求一種新型的,有效的,安全的,穿透力強(qiáng),靶向性高的抗氧劑是拮抗機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)延緩動(dòng)脈粥樣硬化的潛在突破口之一。
　　氫氣是一種無色,無味,無臭具有一定還原性的易燃?xì)怏w。過去許多學(xué)者認(rèn)為氫氣是一種

10、生理性惰性氣體,不會(huì)與機(jī)體生命物質(zhì)發(fā)生生理生化反應(yīng)。但也有極少數(shù)的科學(xué)家認(rèn)為氫氣是一種具有還原性的氣體。發(fā)表在1975年《Science》雜志上的一篇文章報(bào)道,在皮膚鱗狀細(xì)胞癌動(dòng)物模型中,連續(xù)呼吸8個(gè)大氣壓97.5％氫氣兩周,可以有效治療鱗狀細(xì)胞癌,并且研究者認(rèn)為其機(jī)制可能與氫氣的抗氧化作用有關(guān)[9]。之后又有實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),呼吸高壓氫氣能夠治療肝臟寄生蟲感染引起的肝炎,并提出氫氣的抗炎作用機(jī)制可能與氫氣和羥自由基反應(yīng)有關(guān)[10]。雖然上

11、述研究為引起學(xué)者的廣泛關(guān)注,但Ohsawa等2007年發(fā)表在《Nature》上的一篇文章提出,缺血再灌注和炎癥所致的急性氧化應(yīng)激可以導(dǎo)致嚴(yán)重的組織損傷。研究者通過建立大腦缺血再灌注的氧化應(yīng)激大鼠模型,在非高壓的條件下,應(yīng)用吸入氫氣作為治療干預(yù),結(jié)果發(fā)現(xiàn)氫氣能夠通過抗氧化作用減輕大鼠腦缺血再灌注損傷。文中還討論到,氫氣可能具有選擇性的抗氧化作用,也即氫氣只于與·OH和ONOO-發(fā)生反應(yīng),而并不與其它具有生理活性作用的活性氧發(fā)生生物化學(xué)反應(yīng)

12、,如O2-·、H2O2和NO·等。氫氣的這種溫和還原性的優(yōu)點(diǎn),使得它在抗氧化作用的同時(shí)對(duì)機(jī)體內(nèi)部必須的生理反應(yīng)過程影響極小。另外,和生理活性氧O2-·、H2O2和NO·相比,·OH和ONOO-等氧自由基的氧化性明顯高于生理活性氧,而這也使得還原性比較溫和的氫氣只與這些強(qiáng)自由基的發(fā)生中和反應(yīng)。除了這些特點(diǎn)外,氫氣的高物理擴(kuò)散性又是其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)[11]。隨后,日本科學(xué)家Hayashida等在Ohsawa等研究的基礎(chǔ)上,在大鼠心肌梗死缺血再灌

13、注模型中證實(shí)吸入氫氣能夠有助于心梗再灌注后心功能的恢復(fù),減少心肌梗死面積,并預(yù)防心室結(jié)構(gòu)重構(gòu)。實(shí)驗(yàn)再次證實(shí)了氫氣到達(dá)治療靶點(diǎn)的高效性和高通透性[12]。2010年,ChenCH等學(xué)者在大鼠局灶腦缺血過程中,吸入氫氣2小時(shí)能夠降低基質(zhì)金屬蛋白-9活性并減小腦缺血面積[13]。2012年,中國學(xué)者Ge等在大鼠動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)吸入氫氣可以減輕短暫腦缺血誘導(dǎo)的認(rèn)知功能障礙,其可能的機(jī)制為氫氣可以拮抗氧化應(yīng)激作用從而減少神經(jīng)細(xì)胞的死亡[14]。同年

14、,ZhanY學(xué)者等在CritCareMed雜志發(fā)表關(guān)于吸入氫氣治療的實(shí)驗(yàn)研究成果。他們?cè)?30余只硬膜下出血腦損傷的大鼠模型中發(fā)現(xiàn)吸入氫氣2小時(shí)可以明顯減輕腦水腫和血腦屏障損傷[15]。同時(shí)在分子研究層面證實(shí),氫氣可以減輕大腦脂質(zhì),核酸,蛋白質(zhì)的氧化損傷。正如德國學(xué)者Hardeland對(duì)該研究的評(píng)論,吸入氫氣可能是將來醫(yī)學(xué)領(lǐng)域一種頗有前景的治療策略[16]。
　　不僅如此,除了吸入氫氣,科學(xué)家們還利用氫氣擴(kuò)散特點(diǎn)制備成富含氫的溶液

15、并探究其治療作用。最開始是由Sun等學(xué)者提出假設(shè)富含氫的生理鹽水是否依然具有抗氧化應(yīng)激作用。他們?cè)诖笫蟮男墓ＤＰ椭型ㄟ^注射富氫生理鹽水的方法對(duì)心梗后的大鼠進(jìn)行干預(yù),結(jié)果發(fā)現(xiàn)富氫生理鹽水仍然具有有效抗氧化應(yīng)激,減少心肌死亡,改善心功能的治療作用[17]。同期還有中國學(xué)者們發(fā)現(xiàn)富氫生理鹽水對(duì)小腸的缺血再灌注損傷也有保護(hù)作用,并同時(shí)可以改善小腸的收縮功能[18.20]。另外Chen等在大鼠實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),富氫生理鹽水在急性胰腺損傷中能減輕氧化應(yīng)激

16、,減少胰腺細(xì)胞死亡,有意思的是,富氫生理鹽水還能促進(jìn)胰腺腺泡細(xì)胞的增生[21]。因?yàn)楦粴渖睇}水的制備過程并不復(fù)雜,而且有使用方便,便于運(yùn)輸,實(shí)用等特點(diǎn),一時(shí)間將富氫生理鹽水作為治療制劑研究其治療作用的研究迅速成為熱點(diǎn),相應(yīng)的研究結(jié)果均提示富氫溶液作為醫(yī)療制劑的誘人前景[22.30]。
　　盡管如此,人們對(duì)氫的抗氧化作用的具體分子生物學(xué)機(jī)制還未能深入研究。前面我們提到,AGEs可以誘導(dǎo)血管內(nèi)皮的氧化應(yīng)激反應(yīng),從而刺激內(nèi)皮細(xì)胞增生,

17、炎癥細(xì)胞侵潤,凋亡,內(nèi)皮功能障礙,血管粥樣硬化的系列病理改變。氫能否通過抑制AGEs誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激,產(chǎn)生內(nèi)皮保護(hù)作用有待實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)?；诖?我們課題組設(shè)計(jì)了“氫氣抗AGEs誘導(dǎo)的內(nèi)皮凋亡及其機(jī)制”這課題,對(duì)我們的課題假設(shè)進(jìn)行初步證實(shí)。
　　材料和方法：
　　SD大鼠購自于第三軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物室,用于主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)。富含氫氣的培養(yǎng)基被應(yīng)用于模擬高氫氣的環(huán)境。Real-timePCR和分光光度測(cè)定KIT用于抗氧化應(yīng)激酶

18、SOD和GSH-PH基因和蛋白表達(dá)量檢測(cè),DCF-DA作為熒光探針運(yùn)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的活性氧(ROS)水平;AnnexinV-APC凋亡檢測(cè)試劑盒和TUNEL染色法被用于內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的檢測(cè),蛋白印跡分析(WB)用于檢測(cè)Bcl-2(凋亡抑制蛋白)和Bax(凋亡促進(jìn)蛋白)比率分析于說明內(nèi)皮細(xì)胞凋亡水平。
　　結(jié)果：
　　1.AGEs可以誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡并且呈濃度依賴性,HRM組和正常對(duì)照組的細(xì)胞凋亡水平無顯著差異。AGEs

19、組細(xì)胞凋亡水平明顯高于正常對(duì)照組和HRM組,加入HRM能夠明顯抑制AGEs所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。
　　2.流式細(xì)胞儀分析法檢測(cè)發(fā)現(xiàn),加有AGEs的內(nèi)皮細(xì)胞(AGEs組)其細(xì)胞間ROS水平較正常對(duì)照組明顯升高,且升高的水平成濃度依賴關(guān)系。但HRM組細(xì)胞ROS水平和正常對(duì)照組比較我顯著差異。在AGEs+HRM組中發(fā)現(xiàn)細(xì)胞間ROS水平較AGEs組明顯降低,并和正常對(duì)照組相似。
　　3.抗氧應(yīng)激檢測(cè)顯示:在mRNA方面,AGEs能顯著降

20、低SODmRNA的表達(dá)水平,而且這中降低與AGEs呈濃度相關(guān)性。而HRM干預(yù)后能夠明顯改善AGEs對(duì)SODmRNA表達(dá)的抑制作用。另外,在酶活性比較方面,AGEs對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞SOD和GSH-PX這兩種抗氧化酶的酶活性均成抑制效應(yīng),而HRM干預(yù)則能改善AGEs的這種不良效應(yīng)。
　　4.凋亡蛋白水平檢測(cè)發(fā)現(xiàn)AGEs組Bcl-2表達(dá)量較正常對(duì)照組明顯下降,而Bax蛋白表達(dá)量較對(duì)照組明顯增加,Bcl/Bax蛋白表達(dá)量比例在改組明顯下降,提示