金銀花中綠原酸的提取分離及其抑菌作用研究.pdf

1、由于綠原酸對(duì)許多疾病都具有明顯的療效，日益受到醫(yī)學(xué)及藥學(xué)界的重視，社會(huì)需求巨大，但目前國(guó)內(nèi)綠原酸的相關(guān)研究尚非常薄弱，尚無(wú)成熟的綠原酸純品生產(chǎn)工藝。本研究的主要目的是為了建立穩(wěn)定有效的金銀花綠原酸提取純化物的檢測(cè)鑒定方法；明確綠原酸的化學(xué)穩(wěn)定性為其生產(chǎn)和儲(chǔ)存工藝提供參考；通過工藝優(yōu)化尋找更經(jīng)濟(jì)高效的綠原酸提取及分離純化方法；通過對(duì)幾種食品中常見致病菌的綠原酸抑制活性研究，進(jìn)一步明確綠原酸的抑菌活性，完善綠原酸的抗菌譜。研究結(jié)果如下：

2、r>　　綠原酸鑒定檢測(cè)方面：硅膠薄層層析經(jīng)紫外成相分析得知，乙酸乙酯:水:乙酸(v/v,10:3:2)為流動(dòng)相配比，保留因子值達(dá)到0.68；由紫外可見光光度儀在400 nm-200 nm波長(zhǎng)掃描得知綠原酸在紫外327 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，以濃度C（x軸）對(duì)吸光度 A(y軸)作圖繪制 UV標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：y=0.0553x-0.0034，R=0.9996；0～15μg/ml線性關(guān)系良好；經(jīng)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化，高效液相分析參數(shù)為：色譜柱

3、ZOBAX SB(150 mm×4.6 mm,5μm)；流動(dòng)相為甲醇:水:乙酸(18:81:1)，流速:1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng):327 nm，柱溫:30℃，進(jìn)樣量:20μL；此條件下，樣品中綠原酸與相鄰成分基線分離，以濃度C（x軸）對(duì)峰面積V（y軸）作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y=51813 x-5832，R=0.9991，0～13μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；采用外標(biāo)法確認(rèn)提取的綠原酸的保留時(shí)間為8.832 min；同法測(cè)得原料

4、金銀花綠原酸含量為3.3％（n=3，RSD=2.0%），回收率98%；而原料金銀花浸膏的綠原酸含量為10.15%（n=3,RSD=1.8%）。
　　綠原酸的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)表明：相同存儲(chǔ)條件下，綠原酸在pH3.0時(shí)比pH5.6時(shí)更穩(wěn)定；而同樣溶劑條件下，綠原酸于4℃恒溫冰箱避光放置時(shí)比其25℃恒溫儲(chǔ)藏室自然光放置更穩(wěn)定，儲(chǔ)存30天后，經(jīng)單因素Duncan多重函數(shù)檢驗(yàn)比較得出二組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)在置信區(qū)間5%水平上均表現(xiàn)為顯著差異。
　　本

5、文通過對(duì)醇回流法、超聲波提取法、微波輔助提取法等方法的考察發(fā)現(xiàn)微波-超聲波聯(lián)合提取法的綠原酸提取率最高，且提取綠原酸的提取率比目前最普遍采用的70%乙醇回流法的提取率71.15%高20%以上，遠(yuǎn)高于單獨(dú)的超聲法或微波輔助提取法50%的水平。綠原酸經(jīng)微波破壁后繼續(xù)使用20Hz的低頻率超聲波溫和提取，2次重復(fù)綠原酸的提取率即達(dá)到了92.66%；微波-超聲波聯(lián)合提取法正交實(shí)驗(yàn)得出其最佳工藝參數(shù)為：在250 W功率下微波預(yù)處理3次，30 s/次

6、；按料液比（v/v,1/20）加入70%乙醇，在功率18 W下超聲提取20 min，一次性提取率即達(dá)73%以上；各因素的影響從大到小為：超聲功率＞溶劑倍量＞超聲時(shí)間。
　　以重慶金銀花浸膏為原料，以綠原酸提取率為指標(biāo)，采用紫外光譜法、高效液相法定性定量，著重研究比較了金屬離子沉淀法與柱層析（比較聚酰胺、大孔樹酯D101、硅膠G三種填料），結(jié)果表明，三種預(yù)分離方法中聚酰胺柱層析分離獲得的綠原酸純度最高，綠原酸的純度從15％一次性提高

7、至45.2%，增幅達(dá)30%，此時(shí)綠原酸的回收率達(dá)到81.6%；硅膠G柱層析法的產(chǎn)物得率最高，達(dá)到60.6%，但產(chǎn)物中綠原酸含量最低，僅為18.8%；D101大孔樹脂法產(chǎn)物中綠原酸的含量與Zn離子沉淀法相當(dāng)，達(dá)到31%，但是Zn離子沉淀法綠原酸回收率相對(duì)較低，僅為50.0%。綜合考慮綠原酸回收率及綠原酸純度兩個(gè)關(guān)鍵因素，最終確定聚酰胺柱層析為綠原酸的初步純化方法。將聚酰胺柱層析的純化物，進(jìn)行乙酸乙酯萃取，萃取4次即基本萃取完全，濃縮結(jié)晶后

8、，經(jīng)HPLC測(cè)定，純度達(dá)到92%，綠原酸平均回收率為88.4%（RSD＝2.15%）；從將浸膏進(jìn)行聚酰胺柱層析到乙酸乙酯萃取完全的絕對(duì)回收率達(dá)到72.1%（81.6%×88.4%＝72.1%）。
　　本文分別選取兩種革蘭氏陰性菌（志賀氏菌、沙門氏菌）和革蘭氏陽(yáng)性菌（金黃色葡萄球菌和李斯特菌）進(jìn)行綠原酸抑菌活性研究，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，綠原酸對(duì)革蘭氏陰性菌的抑菌活性比革蘭氏陽(yáng)性菌更強(qiáng)，綠原酸水溶液對(duì)志賀氏菌、沙門氏菌的最小抑菌濃度均為0.