缺氧誘導(dǎo)因子-1α基因體外轉(zhuǎn)染骨骼肌細(xì)胞及對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響.pdf

1、目的 離體條件下將HIF-1α基因轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)的大鼠骨骼肌細(xì)胞，觀察轉(zhuǎn)染后細(xì)胞上清液中VEGF的表達(dá)及其對(duì)原代培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響。 方法 1.取出生3天以內(nèi)的Wistar大鼠雙下肢肌肉，利用酶消化法和差速貼壁法分離骨骼肌細(xì)胞。通過(guò)倒置相差顯微鏡觀察培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)，采用Desmin免疫組化、α-sarcometricactin免疫細(xì)胞化學(xué)法鑒定培養(yǎng)細(xì)胞類型及純度，透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)和骨骼肌細(xì)胞特征；取120g左

2、右Wistar大鼠胸主動(dòng)脈以貼塊法培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞，并經(jīng)過(guò)八因子相關(guān)抗原免疫細(xì)胞化學(xué)法鑒定。2.提取和擴(kuò)增pHOX/HIF-1α質(zhì)粒，并經(jīng)酶切和測(cè)序鑒定；以陽(yáng)離子脂質(zhì)體(LipofectamineTM2000)介導(dǎo)pHOX/HIF-1α質(zhì)粒轉(zhuǎn)染骨骼肌細(xì)胞并計(jì)算轉(zhuǎn)染效率；ELISA檢測(cè)轉(zhuǎn)染后VEGF蛋白在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)及細(xì)胞外的分泌情況；將轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后的骨骼肌細(xì)胞所表達(dá)的VEGF蛋白加入血管內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)液中，用MTT法檢測(cè)其對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞增殖的促進(jìn)

3、作用。 結(jié)果 1.成功培養(yǎng)出大鼠的骨骼肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，并經(jīng)免疫組化、免疫細(xì)胞化學(xué)和透射電鏡鑒定證實(shí)。 2.成功將HIF-1α基因轉(zhuǎn)染大鼠的骨骼肌細(xì)胞，熒光顯微鏡下可見(jiàn)綠色熒光蛋白的表達(dá)；在轉(zhuǎn)染組細(xì)胞培養(yǎng)上清中檢測(cè)到VEGF表達(dá)，24h、48h、72h、96h濃度分別為1308.40±102、1449.2±69.86、1802.3±96.71、1494.95±86.24(pg/ml)，明顯高于對(duì)照組(P＜0.01)

4、；轉(zhuǎn)染后骨骼肌細(xì)胞分泌的VEGF具有正常促內(nèi)皮細(xì)胞增殖的功能。轉(zhuǎn)染后骨骼肌細(xì)胞分泌的VEGF對(duì)原代培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)有顯著的促增殖作用，并呈劑量依賴性。在10-100pg范圍內(nèi)，加入24h后，10pg組促增殖作用不明顯，而25、50、100pg組血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖顯著(P＜0.01)，加入48h和72h后，血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖明顯加快，與對(duì)照組相比P＜0.05。 結(jié)論 1.體外條件下成功分離、培養(yǎng)出大鼠骨骼肌細(xì)胞。