白喉毒素?zé)o毒突變體CRM197介導(dǎo)大分子物質(zhì)通過血腦屏障效果和機(jī)制的研究.pdf

1、目的：
　　 血腦屏障的存在極大的限制了大分子藥物通過血腦屏障進(jìn)入腦組織,如何轉(zhuǎn)運(yùn)大分子藥物通過血腦屏障是中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療亟待解決的一個(gè)關(guān)鍵問題。
　　 目前研究表明,通過腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞上的內(nèi)源性受體介導(dǎo)的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)可能是腦內(nèi)藥物轉(zhuǎn)運(yùn)最有效的方法之一。研究者們將藥物或基因轉(zhuǎn)移載體與一些內(nèi)源性受體,如轉(zhuǎn)鐵蛋白或胰島素受體的單克隆抗體偶聯(lián)后,顯示出高效的腦內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)效率。但由于上述單克隆抗體和體內(nèi)的轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島素等內(nèi)源性

2、配體能發(fā)生競爭性抑制作用,從而妨礙了腦組織攝取營養(yǎng)物質(zhì)或藥物。最新研究表明,白喉毒素的無毒突變體--交叉反應(yīng)物質(zhì)197(cross-reacting material 197,CRM197)能夠與分布在腦毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞上的白喉毒素受體(diphtheria toxin receptor,DTR)結(jié)合,轉(zhuǎn)運(yùn)大分子物質(zhì)通過體外血腦屏障。由于CRM197作為莢膜多糖抗原載體蛋白或疫苗在國外已嘗試應(yīng)用于臨床,而且在體內(nèi)不存在與CRM197發(fā)生

3、競爭性抑制作用的內(nèi)源性配體,提示CRM197有可能成為新的更為有效的腦內(nèi)藥物轉(zhuǎn)運(yùn)載體。
　　 藥物通過血腦屏障一般通過兩條途徑:即跨細(xì)胞途徑和細(xì)胞旁途徑。在跨細(xì)胞途徑中,質(zhì)膜微囊蛋白caveolae依賴性跨細(xì)胞途徑在藥物通過血腦屏障的過程中起著重要的作用。Caveolin-1是caveolae的標(biāo)志性蛋白,在維持caveolae的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能中起重要作用。研究表明,FOXO轉(zhuǎn)錄因子能夠直接與caveolin-1的啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合

4、,調(diào)節(jié)caveolin-1的表達(dá)。FOXO轉(zhuǎn)錄因子的活性受磷脂酰肌醇3激酶(phospatidyl-3-inositol-kinase,PI3K)/絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(v-akt routine thymomaviral oncogene homolog,Akt)磷酸化級(jí)聯(lián)通路的調(diào)節(jié),激活的Akt使FOXO發(fā)生磷酸化修飾導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄失活。CRM197與DTR結(jié)合后可以抑制受體剪切,顯著減少肝素結(jié)合表皮生長因子(heparin-bindi

5、ng epidermal growth factor,HB-EGF)的形成,減弱由HB-EGF激活的PI3K/Akt等信號(hào)通路,進(jìn)而可能參與對(duì)FOXO轉(zhuǎn)錄因子活性的調(diào)節(jié),上調(diào)cavcolin-1的表達(dá)。
　　 藥物通過血腦屏障的細(xì)胞旁途徑主要是通過調(diào)節(jié)ZO-1(zonula occluden-1)、occludin、claudin-5等緊密連接相關(guān)蛋白和粘附連接蛋白等結(jié)構(gòu),開放緊密連接,增加血腦屏障通透性。目前對(duì)于CRM197主

6、要通過何種途徑介導(dǎo)大分子物質(zhì)通過血腦屏障的研究尚未見報(bào)道。
　　 本研究主要明確CRM197作用前后對(duì)體外和在體水平血腦屏障的通透性、跨細(xì)胞途徑和細(xì)胞旁途徑的影響,以及在此過程中PI3K/Akt/FOXO1A信號(hào)途徑是否參與對(duì)caveolin-1表達(dá)的調(diào)節(jié)。
　　 方法
　　 1、體外血腦屏障模型和CRM197-HRP(horseradish peroxidase)、BSA-HRP偶聯(lián)物的制備。
　　 2

7、、應(yīng)用CRM197-HRP偶聯(lián)物與人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞hCMEC/D3的結(jié)合實(shí)驗(yàn)和跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)驗(yàn)檢測CRM197-HRP的轉(zhuǎn)運(yùn)效果。
　　 3、應(yīng)用Millicell-ERS電阻測量系統(tǒng)檢測CRM197作用前后體外血腦屏障的跨內(nèi)皮細(xì)胞電阻值(transendothelial electric resistance,TEER)的變化。
　　 4、應(yīng)用伊文氏蘭(Evans blue,EB)滲透性評(píng)估CRM197作用前后豚鼠血腦

8、屏障通透性變化；透射電鏡觀察CRM197對(duì)腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響。
　　 5、應(yīng)用免疫組織化學(xué)法和免疫熒光法檢測CRM197作用前后p-Akt、p-FOXO1A和緊密連接相關(guān)蛋白ZO-1在hCMEC/D3細(xì)胞中的分布和表達(dá)水平的變化；以及caveolin-1和DTR在豚鼠腦微血管中的分布和表達(dá)水平的變化。
　　 6、應(yīng)用RT-PCR法檢測CRM197作用前后hCMEC/D3細(xì)胞中caveolin-1 mRNA的表

9、達(dá)水平；應(yīng)用western blot法檢測CRM197作用前后hCMEC/D3細(xì)胞和豚鼠腦微血管中caveolin-1、緊密連接相關(guān)蛋白ZO-1、occludin和claudin-5的蛋白表達(dá)水平以及PI3K/Akt/FOXO1A信號(hào)通路活性的變化。
　　 結(jié)果
　　 1、成功建立了體外血腦屏障模型,獲得了CRM197-HRP偶聯(lián)物。
　　 2、CRM197-HRP與hCMEC/D3細(xì)胞的結(jié)合實(shí)驗(yàn)表明CRM197

10、-HRP與hCMEC/D3細(xì)胞的結(jié)合水平呈時(shí)間依賴性增加,在60 min時(shí)達(dá)到最大值。
　　 3、CRM197能夠以劑量依賴的方式增加豚鼠血腦屏障的通透性,其中300μg/kg CRM197為開放血腦屏障的最適劑量。CRM197能夠增加腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞中吞飲小泡的數(shù)量,以300μg/kg劑量組增加最明顯。CRM197作用后,腦微血管中DTR的表達(dá)水平顯著減少。
　　 4、CRM197-HRP通過caveolae依賴性的跨

11、細(xì)胞途徑通過血腦屏障。Caveolin-1的mRNA和蛋白表達(dá)水平在CRM197作用后顯著增加,在30 min時(shí)達(dá)到峰值。
　　 5、CRM197作用后,hCMEC/D3細(xì)胞中Akt和FOXO1A的蛋白磷酸化水平均顯著下降,而總Akt的蛋白表達(dá)水平未發(fā)生變化；p-Akt在胞漿和胞核中的表達(dá)水平明顯減弱；FOXO1A在細(xì)胞核中的分布增加。
　　 6、CRM197作用60 min后,體外血腦屏障的TEER值顯著下降,hCME

12、C/D3細(xì)胞中緊密連接相關(guān)蛋白ZO-1在細(xì)胞膜上的表達(dá)減弱,而在胞漿中的表達(dá)明顯增強(qiáng)。CRM197作用60 min后,豚鼠腦微血管中ZO-1和occludin的蛋白表達(dá)水平均顯著減少。Claudin-5的蛋白表達(dá)水平在CRM197作用30 min時(shí)達(dá)到最低,而后增加。
　　 討論
　　 本研究證明,CRM197不僅能介導(dǎo)大分子物質(zhì)HRP(40 kDa)有效通過腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞,而且能以劑量依賴的方式增加豚鼠血腦屏障的通透

13、性。CRM197作用后,腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞中吞飲小泡的數(shù)量增加。CRM197能夠通過caveolae依賴的跨細(xì)胞途徑增加血腦屏障通透性,這一過程伴有caveolin-1的mRNA和蛋白表達(dá)水平的增加,CRM197對(duì)PI3K/Akt信號(hào)途徑的抑制以及對(duì)FOXO1A活性的調(diào)節(jié)能夠參與對(duì)caveolin-1表達(dá)水平的調(diào)節(jié)。CRM197還能減少腦微血管中緊密連接相關(guān)蛋白ZO-1、occludin和claudin-5的表達(dá),增加ZO-1在胞漿中的分

14、布,增加血腦屏障通透性。綜上所述,CRM197能夠通過caveolae依賴性的跨細(xì)胞途徑和細(xì)胞旁途徑介導(dǎo)大分子物質(zhì)通過血腦屏障。
　　 由于不同種屬動(dòng)物的細(xì)胞對(duì)CRM197的敏感性不同,人、猴、豚鼠等對(duì)CRM197敏感,而大鼠和小鼠不敏感。所以本研究主要以hCMEC/D3細(xì)胞和豚鼠為研究對(duì)象。我們首先采用hCMEC/D3細(xì)胞建立了體外血腦屏障模型,并以此為研究對(duì)象檢測了CRM197-HRP與hCMEC/D3細(xì)胞的特異性結(jié)合和內(nèi)化

15、水平,證實(shí)了hCMEC/D3細(xì)胞對(duì)CRM197-HRP的攝取在5 min時(shí)開始增加,在60 min左右達(dá)到平衡。由于血漿中的白蛋白分子量較大(66 kDa),很難通過血腦屏障,經(jīng)常作為對(duì)照來評(píng)價(jià)體外或在體血腦屏障的通透性變化。本研究中,CRM197-HRP與hCMEC/D3細(xì)胞的結(jié)合水平約為BSA-HRP的兩倍,表明CRM197-HRP具有更好的內(nèi)吞效果。在體外血腦屏障模型中,CRM197-HRP與hCMEC/D3細(xì)胞結(jié)合后從trans

16、well小室的上室到下室的轉(zhuǎn)運(yùn)水平要顯著高于其從下室到上室的轉(zhuǎn)運(yùn)水平,這種轉(zhuǎn)運(yùn)方向的優(yōu)勢有助于轉(zhuǎn)運(yùn)CRM197偶聯(lián)物進(jìn)入腦組織。在體研究表明,CRM197能夠以劑量依賴的方式增加豚鼠血腦屏障的通透性,其中300μg/kg和500μg/kg劑量組間EB含量未見顯著差異?？紤]到臨床應(yīng)用的安全性,我們采用300 μg/kg劑量作為開放血腦屏障的最適劑量。CRM197作用后腦微血管中吞飲小泡的數(shù)量增加,提示跨細(xì)胞途徑參與CRM197介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)過

17、程。
　　 結(jié)論
　　 1、CRM197能夠以劑量依賴的方式增加血腦屏障通透性,300 μg/kg CRM197為開放血腦屏障的最適劑量,這一過程伴有腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞中吞飲小泡數(shù)量的增加。
　　 2、CRM197-HRP能有效通過體外血腦屏障,這一過程主要與caveolae依賴性的跨細(xì)胞途徑有關(guān)。
　　 3、CRM197能夠顯著抑制腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞中Akt和FOXO1A的磷酸化水平,增加FOXO1A在細(xì)胞