鮑魚(yú)菇中大分子物質(zhì)抗氧化構(gòu)效關(guān)系及作用機(jī)制的研究.pdf

1、真菌作為天然產(chǎn)物的重要來(lái)源，其抗氧化活性物質(zhì)的研究已經(jīng)顯示出廣闊的發(fā)展前景。本文以食用菌作為研究對(duì)象，圍繞其抗氧化活性物質(zhì)的分離純化、構(gòu)效關(guān)系及抗氧化機(jī)制進(jìn)行研究。
　　 首先，通過(guò)測(cè)定抑制紅細(xì)胞溶血活性的方法對(duì)37種食用菌進(jìn)行篩選，確定將鮑魚(yú)菇（Pleurotus abalonus）子實(shí)體作為抗氧化活性的研究對(duì)象。然后通過(guò)水提醇沉、DEAE纖維素陰離子交換和Sephadex G-200分子篩凝膠層析分離到兩個(gè)具有抗氧化活性的樣

2、品，定名為L(zhǎng)A和LB，LA為純多糖，分子量約為120KD。將LB利用Affi blue gel親和吸附層析進(jìn)一步分離到LB-1、LB-2和LB-3。將具有抗氧化活性的LB-1利用Superdex75分子篩凝膠層析分離得到LB-1a和LB-1b。LB-1b為多糖蛋白復(fù)合物（polysaccharide-protein complex，PPC），分子量約16KD，其蛋白含量為53.04％，糖含量為45.25％，具有顯著的抗氧化活性。

3、　　 通過(guò)對(duì)核磁共振（NMR），信號(hào)進(jìn)行分析，推測(cè)LA的主鏈一級(jí)結(jié)構(gòu)為[-〉6）-α-D-Glcp-（1->]n吡喃型葡萄糖，LB-1b主鏈一級(jí)結(jié)構(gòu)為[-）4）-β-D-Glcp-（1-〉]n吡喃型葡萄糖；通過(guò)高壓液相色譜（HPLC）分析確定LA單糖組成為葡萄糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、木糖、半乳糖和阿拉伯糖，LB-1b單糖組成為葡萄糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸和半乳糖；利用β-消去反應(yīng)發(fā)現(xiàn)N-糖苷鍵是LB-1b中蛋白質(zhì)和多糖的連接方式；通過(guò)氨

4、基酸自動(dòng)分析儀確定LB-1b中含有17種氨基酸，其中8種為人體必需；利用Edman降解法，確定LB-1b N端氨基酸序列為：IPKERKEFQQAQHLK。結(jié)果顯示本研究從真菌中分離到了一個(gè)新化學(xué)結(jié)構(gòu)、高生物活性的多糖蛋白復(fù)合物。
　　 構(gòu)效關(guān)系的研究表明，由于LA和LB-1b的黏度、分子量、溶解度及糖鏈結(jié)構(gòu)的不同，造成其生物活性之間的差別；LB-1b中含有的脯氨酸、組氨酸、蛋氨酸和酪氨酸均被認(rèn)為具有較強(qiáng)的抗氧化活性，可在體內(nèi)被

5、水解后發(fā)揮作用；將LB-1b的蛋白部分與現(xiàn)已報(bào)道的抗氧化蛋白通過(guò)美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（NCBI）進(jìn)行序列比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其N(xiāo)端氨基酸序列之間有一定的相似度，推測(cè)LB-1b的蛋白部分在抗氧化活性中起著重要的作用。研究揭示了真菌中多糖（LA）及多糖蛋白復(fù)合物（LB-1b）的抗氧化構(gòu)效關(guān)系，為開(kāi)發(fā)一種天然、高效、低毒的大分子生物藥物奠定了理論基礎(chǔ)。
　　 在體外實(shí)驗(yàn)中，LA對(duì)1，1-二苯基-2-間三硝苯基-肼基（DPPH）自由基的清

6、除率達(dá)到了77.4％，抑制人類(lèi)免疫缺陷病毒（HIV-1）反轉(zhuǎn)錄酶的活性達(dá)60.51％；LB-1b對(duì)紅細(xì)胞溶血的抑制率為93.02％，對(duì)紅細(xì)胞超氧化物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）酶活的提高率為47.29％，對(duì)乳腺癌細(xì)胞（MCF7）抑制率為84.4％。
　　 在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)對(duì)半乳糖造模衰老小鼠和快速衰老小鼠（SAM）組織的抗氧化酶活性及丙二醛（malonaldehyde，MDA）含量進(jìn)行測(cè)定，確定九月

7、齡SAM為研究天然產(chǎn)物抗氧化機(jī)制的最適動(dòng)物模型。壽命追蹤實(shí)驗(yàn)表明LB-1b可以顯著提高SAM的壽命；九月齡SAM經(jīng)LB-1b處理后，SOD、過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione peroxidase，GPx）的活性均明顯提高，其中CAT在不同組織中的活性均提高50％以上；而MDA含量均下降20％以上；實(shí)時(shí)定量PCR（real-time quantitative PCR.）結(jié)果表明，肝臟中三種