稻瘟病菌α-甘露糖苷酶和幾丁質(zhì)酶多克隆抗體的研制及其應(yīng)用研究.pdf

1、稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)既是重要的經(jīng)濟(jì)作物-水稻稻瘟病病原，也是研究植物與微生物相互作用的重要模式生物。激發(fā)子(elicitor)是研究水稻與稻瘟病菌相互作用的過(guò)程中的重要對(duì)象。稻瘟病菌的很多分泌蛋白可能起激發(fā)子的作用，在已分析過(guò)的稻瘟病菌近1000個(gè)分泌蛋白中，很多是蛋白酶類，通過(guò)對(duì)病菌胞外分泌蛋白酶在各個(gè)生理時(shí)期表達(dá)的檢測(cè)，可以加速對(duì)稻瘟病菌生物學(xué)、致病分子機(jī)制及水稻抗病機(jī)制的認(rèn)識(shí)。 本研究制備了兩種

2、稻瘟病菌蛋白酶α-甘露糖苷酶和幾丁質(zhì)酶的多克隆抗體。稻瘟病菌α-甘露糖苷酶多抗的制備是將過(guò)量表達(dá)α-甘露糖苷酶-His標(biāo)簽融合蛋白的稻瘟病菌的轉(zhuǎn)化子在液體完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)，收集上清中的胞外分泌蛋白，經(jīng)Ni<'2+>-NTA親和柱純化后，得到可溶的α-甘露糖苷酶。然后以α-甘露糖苷酶-His融合蛋白免疫新西蘭雄兔，制備多克隆抗體。ELISA分析表明該抗體效價(jià)達(dá)1:51200，特異性較好。用該抗體對(duì)30個(gè)稻瘟病菌田間菌株培養(yǎng)液進(jìn)行ELISA

3、檢測(cè)和Western Blotting驗(yàn)證，結(jié)果表明不同菌株間α-甘露糖苷酶的表達(dá)量有明顯差異。在親和互作稻瘟病菌菌株70-15與C101A51Pi-2組合中，隨著侵染時(shí)間延長(zhǎng)α-甘露糖苷酶的表達(dá)量增加；而在非親和互作稻瘟病菌70-15與1RBL22組合中，則檢測(cè)不到α-甘露糖苷酶的表達(dá)。 稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)幾丁質(zhì)酶多抗的制備是將稻瘟病菌幾丁質(zhì)酶-His融合基因克隆入表達(dá)載體pET-32a，并在大腸

4、桿菌E.coli BL21(DE3)中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。稻瘟病菌幾丁質(zhì)酶過(guò)表達(dá)菌株經(jīng)0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)4-6 h后，幾丁質(zhì)酶-His融合蛋白經(jīng)Ni<'2+>-NTA親和柱純化后，得到可溶的幾丁質(zhì)酶-His融合蛋白。以幾丁質(zhì)酶-His融合蛋白免疫新西蘭雄兔，制備多克隆抗體。ELISA分析表明該抗體效價(jià)達(dá)1:204800，特異性良好。該抗體對(duì)30個(gè)稻瘟病菌田間菌株培養(yǎng)液進(jìn)行ELISA檢測(cè)和Western Blotting驗(yàn)證，結(jié)