稻瘟病菌Rho族GTP酶功能分析.pdf

1、Rho族蛋白是Ras超家族最主要成員之一，已發(fā)現(xiàn)的有Rho、Rac、Cdc42三個(gè)亞家族近百種蛋白。大量研究結(jié)果表明，Rho族蛋白在調(diào)控與肌動(dòng)蛋白骨架相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，并參與MAP激酶的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程，起著調(diào)節(jié)細(xì)胞極性、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡、基因轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞周期、微管活力、細(xì)胞轉(zhuǎn)化、囊狀運(yùn)輸途徑、從吞噬細(xì)胞的NADPH氧化酶至酵母中葡聚糖合成酶等一系列酶活性、惡性腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移等重要作用。在真菌中，幾乎所有Rho族蛋白都

2、被證實(shí)參與調(diào)控細(xì)胞極性生長(zhǎng)，其還參與調(diào)控細(xì)胞壁合成及其完整性、胞外分泌、細(xì)胞分化等；在絲狀真菌中其還參與調(diào)控侵染致病過(guò)程。 稻瘟病菌(Magnaporthegrisea)是研究絲狀真菌的重要模式生物，也是引起水稻重要病害稻瘟病的病原菌。該菌侵染循環(huán)過(guò)程經(jīng)歷了分生孢子萌發(fā)、附著胞分化、侵入栓的形成以及侵染生長(zhǎng)，這一過(guò)程涉及復(fù)雜的細(xì)胞分化、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和極性生長(zhǎng)。 數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果表明，稻瘟病菌基因組中有7個(gè)Rho族蛋白成員，且通

3、過(guò)基因表達(dá)分析表明這7個(gè)Rho族蛋白在稻瘟病菌中均可表達(dá)，因而我們推測(cè)這些Rho族蛋白在稻瘟病菌生長(zhǎng)發(fā)育以及侵染致病過(guò)程中可能起著極為關(guān)鍵的作用。本論文選擇了具有代表性的兩個(gè)Rho族蛋白成員(MgCdc42和MgRho3)，深入開(kāi)展了功能分析。 MgCdc42在稻瘟病菌分生孢子中表達(dá)最強(qiáng)，通過(guò)構(gòu)建插入失活突變體、持續(xù)激活突變體、負(fù)顯性失活突變體以及過(guò)量表達(dá)突變體，分析了MgCdc42在稻瘟病菌中的功能。研究結(jié)果表明，MgCdc4

4、2插入失活突變導(dǎo)致稻瘟病菌侵入栓形成受抑，從而引起致病性顯著下降；產(chǎn)孢量減少，分生孢子形態(tài)異常，氣生菌絲生長(zhǎng)受抑，菌絲異常；在疏水性表面分生孢子萌發(fā)延遲，附著胞形成滯后、減少，且附著胞異常。而MgCdc42負(fù)顯性突變的結(jié)果與MgCdc42插入失活突變結(jié)果十分相似，最終也導(dǎo)致了稻瘟病菌分生孢子、營(yíng)養(yǎng)菌絲異常，附著胞形成受抑，并導(dǎo)致了侵染能力下降。MgCdc42持續(xù)激活突變體之分生孢子正常，但其菌絲末端分枝增多，附著胞形成減少且侵染能力也大

5、為下降。與這些突變體不同的是，MgCdc42過(guò)量表達(dá)突變體與稻瘟病菌野生型菌株之表型及侵染致病能力差異不顯著。這些結(jié)果表明MgCdc42調(diào)控著稻瘟病菌細(xì)胞分化、極性生長(zhǎng)以及其侵染致病過(guò)程。 MgRho3在稻瘟病菌分生孢子萌發(fā)階段表達(dá)最強(qiáng)，通過(guò)構(gòu)建插入失活突變體以及過(guò)量表達(dá)突變體，其在稻瘟病菌中的功能也得以解析。研究結(jié)果表明，MgRho3插入失活突變體侵染致病能力也顯著下降，但與MgCdc42插入失活導(dǎo)致稻瘟病菌侵入栓形成受抑，并

6、引起致病性顯著下降不同的是，似乎MgRho3插入失活導(dǎo)致稻瘟病菌附著胞形成嚴(yán)重受抑，而引起侵染力下降。MgRho3插入失活還促使稻瘟病菌分生孢子從倒梨形改變?yōu)殚L(zhǎng)橢圓形，產(chǎn)孢量減少；分生孢子萌發(fā)延遲，附著胞形成滯后且降低；菌絲末端分枝增多。與MgCdc42過(guò)量表達(dá)突變體不同的是，MgRho3過(guò)量表達(dá)突變體侵染能力提高，其可能是MgRho3過(guò)量表達(dá)突變體分生孢子可產(chǎn)生雙附著胞引起的。MgRho3過(guò)量表達(dá)突變體產(chǎn)孢量有所提高，附著胞形成提前，

7、菌絲末端分枝增多。以上結(jié)果表明了，與MgCdc42相似，MgRho3也調(diào)控著稻瘟病菌細(xì)胞分化、極性生長(zhǎng)和侵染致病的過(guò)程。洋蔥表皮侵染結(jié)果表明洋蔥表皮對(duì)于MgRho3插入失活突變體的侵染失去了反應(yīng)，而野生型菌株與過(guò)量表達(dá)突變體接種后的洋蔥表皮都能產(chǎn)生強(qiáng)烈的自發(fā)熒光，這似乎預(yù)示著MgRho3在稻瘟病菌與植物互作中的信號(hào)傳導(dǎo)中起著關(guān)鍵作用。 本論文還通過(guò)基因表達(dá)分析以及功能分析，初步明確了MgRho3與MgCdc42的關(guān)系。MgCdc

8、42過(guò)量表達(dá)未能恢復(fù)稻瘟病菌因MgRho3插入失活而引起的生長(zhǎng)發(fā)育以及侵染致病的缺陷。但MgRho3過(guò)量表達(dá)在很大程度上互補(bǔ)了稻瘟病因MgCdc42插入失活而引起的表型缺陷。綜合基因表達(dá)以及功能分析之結(jié)果，我們推測(cè)MgRho3可能處在MgCdc42上游起作用，但兩者可能不只是簡(jiǎn)單的上、下游關(guān)系，對(duì)此本文也進(jìn)行了簡(jiǎn)單的探討。 此外，通過(guò)分析稻瘟病菌基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，以及綜合其他學(xué)者在酵母上研究的結(jié)果，分析了稻瘟病菌MgCdc42可能的