定心方及氧化苦參堿防治心肌缺血再灌注心律失常的作用機(jī)制研究.pdf

1、一、目的： 隨著溶栓療法、經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈腔內(nèi)成形術(shù)、冠狀動(dòng)脈內(nèi)支架置入術(shù)等治療心肌梗塞的推廣應(yīng)用，急性心肌梗塞時(shí)缺血心肌重新得到血液灌注的方法越來越多。實(shí)驗(yàn)和臨床研究發(fā)現(xiàn)心肌缺血后盡早恢復(fù)血流供應(yīng)，能縮小心肌梗塞面積，降低死亡率，但再灌注同時(shí)造成心肌細(xì)胞損傷，表現(xiàn)為再灌注心律失常、心肌組織結(jié)構(gòu)改變、心肌頓抑等，其中再灌注心律失常是再灌注損傷的主要表現(xiàn)，嚴(yán)重的室性心律失常是致心源性猝死的重要原因。因此，探討缺血再灌注心律失常的病理機(jī)

2、制及研究有效的防治藥物意義重大。 西醫(yī)對(duì)心律失常的治療，不論在手術(shù)及電子儀器等方面，均有很大的發(fā)展，但仍以藥物為主。當(dāng)前治療心律失常的藥物很多，但長(zhǎng)期服用都有一定的毒副作用，尤其是抗心律失常的藥物導(dǎo)致的心律失常，引起了醫(yī)藥學(xué)家的特別重視。中醫(yī)藥防治心律失常具有多層次、多角度、多靶點(diǎn)的特征，并且無明顯的毒副作用。本研究采用大鼠缺血再灌注心律失常動(dòng)物模型，研究中藥復(fù)方定心方及單體氧化苦參堿對(duì)再灌注心律失常的防治作用；研究定心方及氧化

3、苦參堿對(duì)再灌注心律失常血清細(xì)胞間粘附分子-1(intercellLlaradhesionmolecule-1，ICAM-1)表達(dá)的影響；同時(shí)利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究再灌注心律失常及定心方和氧化苦參堿干預(yù)后心肌蛋白質(zhì)表達(dá)譜的變化，進(jìn)一步闡述再灌注心律失常的分子機(jī)制和定心方及氧化苦參堿抗心律失常的作用機(jī)理，為臨床上防治再灌注心律失常提供理論依據(jù)。 二、方法： 32只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為4組，每組8只，分別為假手術(shù)組(s

4、hamoperatedgroup，SH)、再灌注組(ischemia-reperfusiongroup，I/R)、定心方干預(yù)組(DingXinRecipegroup，DXR)及氧化苦參堿干預(yù)組(Oxymatrinegroup，OMT)。所有動(dòng)物均適應(yīng)性喂養(yǎng)兩天。SH組、I/R組和OMT組均灌服生理鹽水，DXR組灌服定心方藥液，連續(xù)灌胃7天后，SH組冠脈穿線但不結(jié)扎，I/R、DXR和OMT組手術(shù)造模。 根據(jù)《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》“麻醉

5、大鼠冠脈結(jié)扎和再灌注誘發(fā)心律失常法”制作模型。連接心電圖機(jī)和心電示波器，觀察心律失常的發(fā)生，并詳細(xì)記錄再灌注期間的心律失常，進(jìn)行室性心律失常的量化評(píng)分；腹主動(dòng)脈取血，分離血清；取心臟，冰生理鹽水沖洗，分離左心室，-80℃冰箱保存。 左冠脈結(jié)扎和再灌注誘發(fā)的心律失常以室早(prematureventricularcontraction，VE)、室速(ventriculartachycardia，VT)、室顫(ventricular

6、fibrillation，VF)等室性心律失常(ventriculararrhythmias，VA)為主，故根據(jù)Curtis等創(chuàng)立的VA評(píng)分方法，進(jìn)行室性心律失常評(píng)分。 腹主動(dòng)脈采血分離的血清，采用雙抗體夾心ABC-ELISA法檢測(cè)血清中ICAM-1的表達(dá)，觀察定心方及氧化苦參堿對(duì)再灌注心律失常血清ICAM-1表達(dá)的影響。 部分心肌組織用組織裂解液提取心肌總蛋白，采用Bradford法進(jìn)行蛋白定量。定量后采用雙向電泳技術(shù)

7、分離心肌總蛋白，一向采用IPG3-10L、24cm膠條進(jìn)行水平的等電聚焦，二向進(jìn)行SDS-PAGE垂直電泳。電泳結(jié)束后用考馬斯亮蘭進(jìn)行凝膠染色，后利用UmaxPowerLook1100投射掃描儀采集圖像。所獲得的圖像用Bio-Rad二維圖譜分析軟件PDQuest8.O進(jìn)行圖像分析，軟件自動(dòng)給出差異表達(dá)蛋白質(zhì)點(diǎn)的數(shù)據(jù)信息。切取部分差異明顯的蛋白點(diǎn)送香港大學(xué)基因研究中心進(jìn)行鑒定，獲得的肽質(zhì)量指紋圖譜，采用Mascot軟件在NCBInr數(shù)據(jù)庫(kù)

8、中進(jìn)行搜索，鑒定差異蛋白。 部分心肌組織用Western及IP細(xì)胞裂解液提取心肌組織蛋白，進(jìn)行蛋白印跡實(shí)驗(yàn)。以β-actin為內(nèi)參，將處理好的蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行SDS-PAGE分離，電泳結(jié)束后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，封閉后，孵育一抗和二抗，ECL顯色，KODAKImageStation2000MM成像系統(tǒng)采集圖像，獲得圖像用圖像處理軟件ImageTool3.0測(cè)定并分析條帶灰度值以檢測(cè)FABP的表達(dá)水平。 三、結(jié)果：

9、 1、定心方及氧化苦參堿對(duì)大鼠缺血再灌注心律失常的影響。 各組心律失常評(píng)分經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，有顯著性差異(x2=20.614，P=0.000<0.01)。SH組大鼠偶見室性早搏，未見其它心律失常：I/R組大鼠8例均發(fā)生心律失常，多數(shù)大鼠冠脈再通1min就開始出現(xiàn)心律失常，以頻發(fā)室早、室速、室顫等為主，還有少量的房室傳導(dǎo)阻滯，其中1例因室顫死亡，VA評(píng)分與SH組比較顯著增高(P=0.000<0.01)；DXR組8例也均出現(xiàn)心律失常

10、，但以室早和室速為主，VA評(píng)分與I/R組相比顯著減少(P=0.013<0.015)；OMT組心律失常類型也以室早和室速為主，其中2例僅見偶爾的室性早搏，VA評(píng)分與I/R組相比也顯著減少(P=0.005<0.01)。 2、定心方及氧化苦參堿對(duì)血清ICAM-1表達(dá)的影響。 各組血清ICAM-1含量經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析有顯著性差異(F=4.233，P=0.014<0.05)。I/R組大鼠血清ICAM-1的含量較SH組顯著升高，差異有統(tǒng)

11、計(jì)學(xué)意義(P=0.007<0.05)；而定心方和氧化苦參堿干預(yù)后，血清ICAM-1含量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.003、0.049<0.05)，其中定心方與氧化苦參堿相比，定心方有較好的干預(yù)作用，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.241>0.05)。 3、再灌注心律失常及定心方和氧化苦參堿干預(yù)后大鼠心肌蛋白質(zhì)表達(dá)譜的變化。 心肌缺血再灌注后，I/R組蛋白譜與SH組蛋白譜比較，有71個(gè)點(diǎn)有明顯差異，DXR組有73個(gè)蛋白點(diǎn)與

12、I/R組有明顯差異，其中I/R組與SH組的差異71個(gè)點(diǎn)中，有32個(gè)差異點(diǎn)經(jīng)DXR治療后，有明顯恢復(fù)，接近于正常；OMT組與I/R組比較，明顯差異的點(diǎn)84個(gè)，其中I/R組與SH組的差異71個(gè)點(diǎn)中，有30個(gè)差異點(diǎn)經(jīng)OMT治療后，有明顯恢復(fù)，接近于正常。經(jīng)進(jìn)一步比較，OMT與DXR作用后表達(dá)變化一致的點(diǎn)有8個(gè)。 4、部分差異蛋白點(diǎn)的鑒定。 對(duì)所獲得的部分差異蛋白點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜分析，獲得5張肽質(zhì)量指紋圖譜，這些肽質(zhì)量指紋圖譜經(jīng)Mas

13、cot搜索數(shù)據(jù)庫(kù)成功鑒定出其中4個(gè)蛋白質(zhì)，它們分別為白蛋白(albumin)、抗增殖蛋白(prohibitin)、心肌脂肪酸結(jié)合蛋白(fattyacidbindingprotein，F(xiàn)ABP)、線粒體醛脫氫霉(mitochondrialaldehydedehydrogenase.mtALDH)。 5、FABP蛋白表達(dá)水平的驗(yàn)證。 為驗(yàn)證質(zhì)譜鑒定得出的FABP在心肌組織中的表達(dá)，我們應(yīng)用半定量westernblot分析檢測(cè)

14、各組心肌組織中FABP。通過分析結(jié)果中目的條帶圖像發(fā)現(xiàn)，各組心肌組織中FABP的表達(dá)有顯著性差異(F=12.007，P=0.002<0.05)。I/R組FABP的表達(dá)較SH組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000<0.05)，經(jīng)定心方和氧化苦參堿干預(yù)后，F(xiàn)ABP的表達(dá)明顯降低，有顯著性差異(P=0.007、0.002<0.05)，與2DE分析結(jié)果一致。 四、結(jié)論： 1、大鼠缺血再灌注損傷容易誘發(fā)心律失常，定心方及氧化苦參