定心方及氧化苦參堿防治心肌缺血再灌注心律失常的作用機制研究.pdf

1、一、目的： 隨著溶栓療法、經(jīng)皮冠狀動脈腔內(nèi)成形術(shù)、冠狀動脈內(nèi)支架置入術(shù)等治療心肌梗塞的推廣應(yīng)用，急性心肌梗塞時缺血心肌重新得到血液灌注的方法越來越多。實驗和臨床研究發(fā)現(xiàn)心肌缺血后盡早恢復(fù)血流供應(yīng)，能縮小心肌梗塞面積，降低死亡率，但再灌注同時造成心肌細(xì)胞損傷，表現(xiàn)為再灌注心律失常、心肌組織結(jié)構(gòu)改變、心肌頓抑等，其中再灌注心律失常是再灌注損傷的主要表現(xiàn)，嚴(yán)重的室性心律失常是致心源性猝死的重要原因。因此，探討缺血再灌注心律失常的病理機

2、制及研究有效的防治藥物意義重大。 西醫(yī)對心律失常的治療，不論在手術(shù)及電子儀器等方面，均有很大的發(fā)展，但仍以藥物為主。當(dāng)前治療心律失常的藥物很多，但長期服用都有一定的毒副作用，尤其是抗心律失常的藥物導(dǎo)致的心律失常，引起了醫(yī)藥學(xué)家的特別重視。中醫(yī)藥防治心律失常具有多層次、多角度、多靶點的特征，并且無明顯的毒副作用。本研究采用大鼠缺血再灌注心律失常動物模型，研究中藥復(fù)方定心方及單體氧化苦參堿對再灌注心律失常的防治作用；研究定心方及氧化

3、苦參堿對再灌注心律失常血清細(xì)胞間粘附分子-1(intercellLlaradhesionmolecule-1，ICAM-1)表達的影響；同時利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究再灌注心律失常及定心方和氧化苦參堿干預(yù)后心肌蛋白質(zhì)表達譜的變化，進一步闡述再灌注心律失常的分子機制和定心方及氧化苦參堿抗心律失常的作用機理，為臨床上防治再灌注心律失常提供理論依據(jù)。 二、方法： 32只雄性Wistar大鼠隨機分為4組，每組8只，分別為假手術(shù)組(s

4、hamoperatedgroup，SH)、再灌注組(ischemia-reperfusiongroup，I/R)、定心方干預(yù)組(DingXinRecipegroup，DXR)及氧化苦參堿干預(yù)組(Oxymatrinegroup，OMT)。所有動物均適應(yīng)性喂養(yǎng)兩天。SH組、I/R組和OMT組均灌服生理鹽水，DXR組灌服定心方藥液，連續(xù)灌胃7天后，SH組冠脈穿線但不結(jié)扎，I/R、DXR和OMT組手術(shù)造模。 根據(jù)《藥理實驗方法學(xué)》“麻醉

5、大鼠冠脈結(jié)扎和再灌注誘發(fā)心律失常法”制作模型。連接心電圖機和心電示波器，觀察心律失常的發(fā)生，并詳細(xì)記錄再灌注期間的心律失常，進行室性心律失常的量化評分；腹主動脈取血，分離血清；取心臟，冰生理鹽水沖洗，分離左心室，-80℃冰箱保存。 左冠脈結(jié)扎和再灌注誘發(fā)的心律失常以室早(prematureventricularcontraction，VE)、室速(ventriculartachycardia，VT)、室顫(ventricular

6、fibrillation，VF)等室性心律失常(ventriculararrhythmias，VA)為主，故根據(jù)Curtis等創(chuàng)立的VA評分方法，進行室性心律失常評分。 腹主動脈采血分離的血清，采用雙抗體夾心ABC-ELISA法檢測血清中ICAM-1的表達，觀察定心方及氧化苦參堿對再灌注心律失常血清ICAM-1表達的影響。 部分心肌組織用組織裂解液提取心肌總蛋白，采用Bradford法進行蛋白定量。定量后采用雙向電泳技術(shù)

7、分離心肌總蛋白，一向采用IPG3-10L、24cm膠條進行水平的等電聚焦，二向進行SDS-PAGE垂直電泳。電泳結(jié)束后用考馬斯亮蘭進行凝膠染色，后利用UmaxPowerLook1100投射掃描儀采集圖像。所獲得的圖像用Bio-Rad二維圖譜分析軟件PDQuest8.O進行圖像分析，軟件自動給出差異表達蛋白質(zhì)點的數(shù)據(jù)信息。切取部分差異明顯的蛋白點送香港大學(xué)基因研究中心進行鑒定，獲得的肽質(zhì)量指紋圖譜，采用Mascot軟件在NCBInr數(shù)據(jù)庫

8、中進行搜索，鑒定差異蛋白。 部分心肌組織用Western及IP細(xì)胞裂解液提取心肌組織蛋白，進行蛋白印跡實驗。以β-actin為內(nèi)參，將處理好的蛋白質(zhì)樣品進行SDS-PAGE分離，電泳結(jié)束后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，封閉后，孵育一抗和二抗，ECL顯色，KODAKImageStation2000MM成像系統(tǒng)采集圖像，獲得圖像用圖像處理軟件ImageTool3.0測定并分析條帶灰度值以檢測FABP的表達水平。 三、結(jié)果：

9、 1、定心方及氧化苦參堿對大鼠缺血再灌注心律失常的影響。 各組心律失常評分經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，有顯著性差異(x2=20.614，P=0.000<0.01)。SH組大鼠偶見室性早搏，未見其它心律失常：I/R組大鼠8例均發(fā)生心律失常，多數(shù)大鼠冠脈再通1min就開始出現(xiàn)心律失常，以頻發(fā)室早、室速、室顫等為主，還有少量的房室傳導(dǎo)阻滯，其中1例因室顫死亡，VA評分與SH組比較顯著增高(P=0.000<0.01)；DXR組8例也均出現(xiàn)心律失常

10、，但以室早和室速為主，VA評分與I/R組相比顯著減少(P=0.013<0.015)；OMT組心律失常類型也以室早和室速為主，其中2例僅見偶爾的室性早搏，VA評分與I/R組相比也顯著減少(P=0.005<0.01)。 2、定心方及氧化苦參堿對血清ICAM-1表達的影響。 各組血清ICAM-1含量經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析有顯著性差異(F=4.233，P=0.014<0.05)。I/R組大鼠血清ICAM-1的含量較SH組顯著升高，差異有統(tǒng)

11、計學(xué)意義(P=0.007<0.05)；而定心方和氧化苦參堿干預(yù)后，血清ICAM-1含量降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.003、0.049<0.05)，其中定心方與氧化苦參堿相比，定心方有較好的干預(yù)作用，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.241>0.05)。 3、再灌注心律失常及定心方和氧化苦參堿干預(yù)后大鼠心肌蛋白質(zhì)表達譜的變化。 心肌缺血再灌注后，I/R組蛋白譜與SH組蛋白譜比較，有71個點有明顯差異，DXR組有73個蛋白點與

12、I/R組有明顯差異，其中I/R組與SH組的差異71個點中，有32個差異點經(jīng)DXR治療后，有明顯恢復(fù)，接近于正常；OMT組與I/R組比較，明顯差異的點84個，其中I/R組與SH組的差異71個點中，有30個差異點經(jīng)OMT治療后，有明顯恢復(fù)，接近于正常。經(jīng)進一步比較，OMT與DXR作用后表達變化一致的點有8個。 4、部分差異蛋白點的鑒定。 對所獲得的部分差異蛋白點進行質(zhì)譜分析，獲得5張肽質(zhì)量指紋圖譜，這些肽質(zhì)量指紋圖譜經(jīng)Mas

13、cot搜索數(shù)據(jù)庫成功鑒定出其中4個蛋白質(zhì)，它們分別為白蛋白(albumin)、抗增殖蛋白(prohibitin)、心肌脂肪酸結(jié)合蛋白(fattyacidbindingprotein，F(xiàn)ABP)、線粒體醛脫氫霉(mitochondrialaldehydedehydrogenase.mtALDH)。 5、FABP蛋白表達水平的驗證。 為驗證質(zhì)譜鑒定得出的FABP在心肌組織中的表達，我們應(yīng)用半定量westernblot分析檢測

14、各組心肌組織中FABP。通過分析結(jié)果中目的條帶圖像發(fā)現(xiàn)，各組心肌組織中FABP的表達有顯著性差異(F=12.007，P=0.002<0.05)。I/R組FABP的表達較SH組升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000<0.05)，經(jīng)定心方和氧化苦參堿干預(yù)后，F(xiàn)ABP的表達明顯降低，有顯著性差異(P=0.007、0.002<0.05)，與2DE分析結(jié)果一致。 四、結(jié)論： 1、大鼠缺血再灌注損傷容易誘發(fā)心律失常，定心方及氧化苦參