黃金梨ACC氧化酶基因過量表達載體構(gòu)建及其擬南芥突變體驗證.pdf

1、黃金梨(Pyrus pyrifolia cv.Whangkeumbae)屬砂梨系統(tǒng)，為我國主栽品種之一。黃金梨果實質(zhì)優(yōu)味美，但其貨架期短，采摘后在常溫條件下貯存易失水、黑心及腐爛，極大地影響了其采后品質(zhì)。本研究以黃金梨果實為材料，依據(jù)已經(jīng)公布的黃金梨果實PpACO1基因序列（基因登錄號:JN807390），從黃金梨果實中克隆得到PpACO1基因，并以其作為目的片段，采用較為常用的植物表達載體pBI121構(gòu)建了CaMV35S∷PpA CO

2、1過量表達載體;同時以從擬南芥生物資源中心(Arabidopsis BiologicalResource Center，ABRC)購入的AtA CO2基因缺失擬南芥為材料，用三引物法驗證其突變體的純合性，并用得到的ataco2純合突變體擬南芥（以下簡稱ataco2突變體）為試材，以哥倫比亞野生型擬南芥（以下簡稱Col-0）為對照，研究了ataco2突變體與Col-0的表型及生理差異。黃金梨ACC氧化酶基因過量表達載體的構(gòu)建及其擬南芥突變

3、體的驗證為研究黃金梨ACC氧化酶基因功能奠定基礎(chǔ)，并為利用分子生物學(xué)手段改良黃金梨果實的耐貯性、改善其采后品質(zhì)提供參考依據(jù)。主要研究結(jié)果如下:
　　1.設(shè)計并合成正向引物ACO1-F和反向引物ACO1-R，用RT-PCR的方法從黃金梨果實的cDNA中克隆得到PpACO1基因編碼區(qū)全長。
　　2.設(shè)計并合成分別帶有XbaⅠ和SacⅠ酶切連接位點的正向引物ACO1-EF和反向引物ACO1-ER，以PpACO1基因全長為模板擴增得

4、到目的片段，并用TA克隆將該片段克隆到pMD19-T載體上。用XbaⅠ和SacⅠ將目的片段從T載體克隆產(chǎn)物上切下，并用T4 DNA連接酶將其連接到用XbaⅠ和SacⅠ雙酶切的植物雙元表達載體pBI121的CaMV35S啟動子下游。通過PCR及雙酶切鑒定其正確性，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞，通過測序及序列比對證明PpACO1基因已成功插入，CaMV35S∷PpACO1重組過量表達載體構(gòu)建成功。
　　3.從ABRC購入擬南芥At

5、A CO1、AtACO2基因T-DNA插入突變體，用三引物法驗證得到了擬南芥AtACO2基因T-DNA插入純合突變體。
　　4.Col-0與ataco2突變體的表型研究表明，AtACO2基因的缺失延緩了種子萌發(fā)、減弱了“三重反應(yīng)”、使蓮座葉直徑顯著減小、推遲開花且使花期延長。
　　5.通過研究Col-0與ataco2突變體中超氧物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)、過氧化物酶(Peroxidase，P