基因芯片在病毒性肝炎分子診斷及基因表達譜研究中的應用.pdf

1、肝炎病毒是引起急慢病毒性肝炎的主要致病原因之一，全球范圍內(nèi)有5億多人感染了慢性肝炎。病毒性肝炎傳染性強、傳播途徑復雜、流行面廣和發(fā)病率高，可演變?yōu)槁愿窝住⒏斡不约案渭毎?HepatocellularCarcinoma,HCC)。建立早期、敏感的方法對肝炎的診斷和預防將是目前控制肝炎繼續(xù)發(fā)展的重要途徑。乙型病毒性肝炎在我國是高流行區(qū)，已成為一個重要的健康問題，年發(fā)病率為158/10萬，現(xiàn)患慢性肝炎的病人約為1800萬人，其中40％的

2、患者逐漸發(fā)展為更為嚴重的各種肝并發(fā)癥，包括肝硬化和HCC等，而受乙型肝炎病毒(HBV)慢性感染的人群罹患HCC的相對危險性比正常人群至少增加300倍；丙型肝炎在我國整體人群流行率為1～3％，丙型肝炎病毒(HCV)感染約70％～80％會轉為慢性，遠遠高于乙型肝炎的慢性化率(5％～10％)，約20％會發(fā)展成肝硬化，其中約5％在20～30年內(nèi)發(fā)展為HCC。到目前為此，沒有十分有效的方法來防止和控制HCV的感染，也沒有較為有效的疫苗，所以建立早

3、期診斷HCV感染的方法十分重要。HCV有多種基因型，不同HCV基因型感染所致疾病的嚴重程度不同，1型及混合型較重，2型較輕，不同基因型對干擾素(IFN)應答及病毒血癥水平存在差異；丁型肝炎病毒(HDV)是一種缺陷病毒，需要HBV的輔助才能感染和復制。乙型肝炎患者重疊感染HDV，常導致肝炎的重型化和慢性化。 雖然許多HBV感染的分子機理研究都證實，HBV感染肝細胞后，誘導的肝損傷并非只是病毒的直接細胞毒作用，而是主要激活宿主免疫應

4、答反應，但病毒感染及其致病機理仍不十分清楚，與肝細胞之間相互作用的分子機制也了解很少。近年來，逐漸從局限于研究病毒基因結構和功能轉向對病毒宿主相互關系的研究，病毒編碼的蛋白能夠影響肝細胞某些基因的表達從而影響細胞生長調(diào)節(jié)可能是病毒感染致病及最終致癌的重要因素。肝炎蛋白的表達不僅對于HBV的生活周期具有重要意義，而且對于肝細胞基因表達譜產(chǎn)生重要影響。例如有研究顯示，HBV的X基因編碼產(chǎn)物(HbxAg)是一種具有反式激活作用的病毒蛋白，能夠

5、影響細胞信號轉導途徑，激活多種病毒及細胞基因啟動子，影響細胞分化與增殖，在HBV感染與HCC發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮十分重要作用。但是由于肝炎病毒與宿主細胞和機體相互作用關系的多樣性和復雜性，傳統(tǒng)常用的從單個或幾個特定的因素研究病毒感染對宿主的影響，不足以找到規(guī)律性的結果，有必要引入新的策略和技術。 目前臨床上肝炎病毒診斷主要方法有免疫學上傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)及分子生物學方法等。ELISA檢測方法檢測的對象是抗原和抗體

6、，由于人體對肝炎病毒產(chǎn)生免疫應答有“窗口期”，所以人體對病毒感染免疫應答有一定遲滯，對無免疫應答或免疫力低下者的檢測更存在困難。另外，檢測的特異性和敏感性也不夠好。近年來發(fā)展的各種核酸雜交方法和聚合酶鏈反應(PCR)方法各具優(yōu)點，可對其進行定性、分型、半定量和定量檢測，不過核酸雜交雖有一定的特異性，但敏感性較低；而PCR操作容易造成交叉污染，假陽性、假陰性結果經(jīng)常出現(xiàn)，且存在操作較繁瑣、一次檢測的病毒種類、型別有限、檢測的效率和自動化程

7、度不高。因而發(fā)展更有效、更科學、更直接、簡化的方法，用于肝炎病毒的臨床檢測、分型十分必要。 基因芯片技術是上世紀90年代興起，源于計算機集成化芯片理念的一門新技術。實質就是利用Southernblot原理，以可尋址的方式在載體表面，有序地點陣排列大量DNA雙鏈或oligo探針。這些被固定在基質的探針就形成了高密度DNA微陣列。樣品DNA或RNA經(jīng)過熒光標記，與陣列上的探針進行雜交反應，按照堿基互補配對原則，探針特異性地結合相應被

8、熒光標記的分子。用激光激發(fā)熒光標記物，就可獲得樣品分子的信息，從而對基因序列及功能進行大規(guī)模、高通量、平行地研究。DNA芯片技術為肝炎病毒診斷提供了一種快速、敏感、高通量、高效的方法，并可同時對多種肝炎病毒進行大規(guī)模篩查和多種肝炎種類的鑒定，芯片技術在病毒性肝炎診斷上的價值還在于，能對各種肝炎病毒的各亞型、變異株、耐藥性等情況，通過一張芯片同時診斷出來。應用診斷芯片可為臨床上病毒性肝炎的診斷、用藥、療效判定及疾病的發(fā)生、發(fā)展與轉歸提供可

9、靠依據(jù)，具有非常大的發(fā)展前景。 論文全文共分為三部分： 1.肝炎病毒聯(lián)合診斷cDNA芯片的制備與應用 對于基因組較小的HBV、HDV，利用普通PCR技術制備探針，采用PrimerPremier5.0軟件分別針對HBV、HDV保守區(qū)域設計特異引物，得到各10條、4條探針；利用限制性顯示-PCR(RestrictionDisplay,RD-PCR)技術制備基因組較大且復雜的HCV芯片探針：首先運用該技術建立了HCV三

10、個亞型的cDNA文庫，在分離RD產(chǎn)物條帶時，還用到了聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)電泳結合銀染法。由pCV-H77C(HCV-1a)克隆共得到大小從222bp到840bp(含兩端共38bp長的接頭，以下同)共22個限制性片段，由pCV-J4L6S(HCV-1b)得到216bp至907bp間片段共23個，由pJ6CF(HCV-2a)得到218bp至878bp間片段共21個；然后，從中選取了基因片段作為芯片探針。為了便于摸索實驗條件和更好進行探

11、針優(yōu)化，我們先后制備了3種芯片，包括HBV與HDV診斷芯片、HCV診斷芯片及HBV、HDV、HCV聯(lián)合診斷芯片。雜交結果顯示HBV、HDV診斷芯片、HCV優(yōu)化診斷芯片效果較為滿意。從以上芯片中選取探針制備了HBV、HDV、HCV聯(lián)合診斷芯片，對芯片的檢測質量進行了初步的評估：線性在104～1011copies/mL之間，芯片檢測法顯示了較好的線性(r分別為0.9902、0.9921、0.9819，P＜0.01)，其中稀釋最低濃度水平為H

12、BV0.92×104copies/mL、HDV1.08×104copies/mL、HCV1.03×104copies/mL，初步認定該芯片三種肝炎病毒的檢測靈敏度不低于此水平；特異性：所制備的芯片檢測YFV、JEV、DV等其他病毒樣品結果均顯示為陰性，顯示有著較好的特異性；重復性：HBV、HDV、HCV的檢測重復性分別為：批內(nèi)精密度CV值為7.1％、7.2％、6.6％，批間精密度CV值為7.9％、8.2％、7.6％；準確性：將共計HBV

13、、HDV14條PCR片段，HCV24條限制性片段，部分臨床陽性血清(PCR產(chǎn)物)全部進行序列測定，與GenBank進行BLAST比較，結果表明克隆基因均屬于相應基因，與理論一致。為了適應臨床診斷的要求，能快速、敏感地檢測血清標本，我們對實驗條件進行了一些優(yōu)化，包括減少雜交時間從常規(guī)的過夜雜交(16h)到2h，取消預雜交步驟，標記的樣品不經(jīng)過純化，利用商用試劑盒對血清核酸進行快速高效提取，將雜交時間從42℃提高到52℃等措施。通過這些改進

14、，可以使病毒檢測在送檢標本當天出報告，敏感性也大大提高。 2.肝炎病毒診斷分型寡核苷酸芯片的制備與應用 從GenBank數(shù)據(jù)庫獲取HBV全長DNA序列，HDV及HCV4個基因型全長cDNA序列，根據(jù)BLAST分析結果獲得HBV、HDV種屬保守序列及HCV各型特異性序列，以作為設計寡核苷酸(Oligo)探針的備選序列。用Arraydesigner3.0分別對BLAST檢索所得的HBV、HDV種屬保守序列和HCV型特異性序列

15、逐一進行分析，設計長度均一的60meroligo探針。為了保證設計的探針具有高度的特異性和靈敏度，設計時使探針Tm值在80±5℃之間，GC含量介于40％～60％，且探針內(nèi)部和探針之間不易形成穩(wěn)定的二級結構。在BLAST比對中，與其它基因的同源性小于70％，連續(xù)相同堿基的數(shù)量不超過18個。遵循以上探針設計的原則，從HBV、HDV、HCV種屬保守序列和HCV型特異性序列中分別挑選出16、8、68條60meroligo探針。Oligo探針合成

16、和純化后，用芯片打印儀固定在玻片上。為便于研究，先后制備了2種芯片，包括HBV、HDV診斷芯片、HCV分型芯片。同cDNA芯片一樣，我們采用RD-PCR技術進行樣品熒光標記后與芯片雜交，并根據(jù)雜交結果篩除了有非特異雜交和信噪比低于4.0的探針，選取高特異的探針制備了HBV、HDV、HCV聯(lián)合診斷分型芯片。 3.利用寡核苷酸芯片對乙型肝炎基因表達譜的研究 本實驗選用AgilentHumanlAoligo基因芯片進行乙型肝炎

17、基因表達改變的研究，探討HBV感染的分子致病機理。對照細胞株HepG2，為分化較好的人肝癌細胞，所產(chǎn)生蛋白的功能與正常肝細胞近似；實驗細胞株HepG2.2.15，為HBVDNA轉染HepG2而成，可持續(xù)穩(wěn)定地分泌Dane顆粒及HBsAg、HBeAg、HBVDNA等。用Cy3標記實驗細胞HepG2.2.15，Cy5標記對照細胞HepG2。通過雜交、掃描、統(tǒng)計學分析，根據(jù)PValueLogRatio值及gProcessedsignal/rP