HBx與survivin協(xié)同致癌調(diào)節(jié)HBXIP作用分子機(jī)制的研究.pdf

1、乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染與肝癌的發(fā)生具有十分密切的關(guān)系,乙肝病毒X蛋白(HBx)在肝癌的發(fā)生發(fā)展中具有十分重要的作用。然而,HBx的致癌作用機(jī)理目前仍不十分清楚。我們實(shí)驗(yàn)室前期研究工作發(fā)現(xiàn),在HBx導(dǎo)致的惡性轉(zhuǎn)化過(guò)程中,HBx、survivin和HBXIP三者形成復(fù)合物協(xié)同發(fā)揮轉(zhuǎn)化功能,HBx和survivin扮演了至關(guān)重要的角色,HBXIP不但發(fā)揮橋梁功能連接HBx和survivin,使三者形成復(fù)

2、合物；而且本身還具有重要的致癌作用。為了進(jìn)一步闡明HBx與肝癌發(fā)病的關(guān)系,本研究應(yīng)用人正常肝細(xì)胞系,探討了HBx和survivin對(duì)HBXIP的上調(diào)作用,對(duì)其分子機(jī)制進(jìn)行了詳細(xì)研究。
　　 主要研究?jī)?nèi)容分為三個(gè)部分:
　　 一、HBXIP基因啟動(dòng)子的鑒定及其功能分析
　　 實(shí)驗(yàn)室前期工作建立了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HBX基因和survivin基因的細(xì)胞系,分別命名為L(zhǎng)O2-X、L-O2-S和L-O2-X-S,以此作為研究HBX

3、IP啟動(dòng)子的細(xì)胞模型。為了篩選HBXIP基因啟動(dòng)子的功能片段,以細(xì)胞基因組為模板,通過(guò)NCBI篩選出HBXIP基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游序列并設(shè)計(jì)多對(duì)引物,PCR擴(kuò)增后將其產(chǎn)物連接到T載體進(jìn)行測(cè)序鑒定；測(cè)序成功后將該基因亞克隆至pGL3-Basic熒光報(bào)告基因載體上；瞬時(shí)轉(zhuǎn)染LO2-X-S、H74O2、HepG2等細(xì)胞系,然后用雙熒光報(bào)告檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)不同片段的熒光活性。結(jié)果顯示,P-3233/-1673(包含CREB結(jié)合位點(diǎn))的熒光素酶活性是

4、pGL3-Basic的8倍以上,而其他啟動(dòng)子片段(不包含CREB結(jié)合位點(diǎn))熒光素酶活性則相對(duì)較低。這表明P-32331/-1673區(qū)域內(nèi)存在調(diào)節(jié)HBXIP轉(zhuǎn)錄的順時(shí)作用元件,同時(shí)CREB結(jié)合位點(diǎn)可能在HBXIP的轉(zhuǎn)錄活性調(diào)控中起一定作用。
　　 二、HBx和survivin對(duì)HBXIP啟動(dòng)子甲基化水平的影響分析
　　 本實(shí)驗(yàn)室的前期研究工作已證明HBXIP發(fā)揮橋梁的功能連接HBx和survivin使三者形成復(fù)合物導(dǎo)致正常

5、肝細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。我們?cè)诠厕D(zhuǎn)HBx和survivin的細(xì)胞系LO2-X-S中通過(guò)RT-PCR發(fā)現(xiàn)HBXIP在mRNA水平上調(diào),免疫印跡技術(shù)發(fā)現(xiàn)HBXIP蛋白表達(dá)水平上調(diào)。為了在表觀遺傳修飾水平闡明HBx和survivin協(xié)同上調(diào)HBXIP的分子機(jī)制,我們應(yīng)用硫酸鹽DNA測(cè)序法檢測(cè)了HBXIP啟動(dòng)子的甲基化水平。結(jié)果顯示,相對(duì)于LO2,LO2-X,LO2-S細(xì)胞系,LO2-X-S細(xì)胞系中HBXIP啟動(dòng)子的三個(gè)CpG島-2165/-217

6、1,-2282/-2287和-2326/-2330處于低甲基化狀態(tài),這與HBXIP表達(dá)上調(diào)相一致。該結(jié)果表明,HBx和survivin可共同誘導(dǎo)HBXIP啟動(dòng)子區(qū)域的去甲基化從而促進(jìn)其表達(dá)。
　　 三、HBx和survivin通過(guò)CREB轉(zhuǎn)錄因子促進(jìn)HBXIP的轉(zhuǎn)錄
　　 已有文獻(xiàn)報(bào)道HBx蛋白可與轉(zhuǎn)錄因子cAMP應(yīng)答元件結(jié)合蛋(cAMPresponse element-binding protein,CREB)結(jié)合來(lái)調(diào)

7、節(jié)其靶基因的轉(zhuǎn)錄。我們通過(guò)對(duì)HBXIP啟動(dòng)子序列分析發(fā)現(xiàn),HBXIP啟動(dòng)子序列中含有cAMP反應(yīng)元件(cAMP response element,CRE)。本研究應(yīng)用染色質(zhì)免疫共沉淀檢測(cè)發(fā)現(xiàn),HBx蛋白可與HBXIP基因相結(jié)合,但干擾CREB后HBx蛋白則不能與HBXIP基因結(jié)合。說(shuō)明HBx蛋白可通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子CREB來(lái)調(diào)控HBXIP的表達(dá)。那么survivin在該過(guò)程中發(fā)揮什么作用呢?為了說(shuō)明這一問(wèn)題,我們將survivin干擾后用HB