信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白α調(diào)節(jié)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞功能的作用與機(jī)制研究.pdf

1、本研究分為二部分：
　　 第一部分、信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白α調(diào)節(jié)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞功能的作用與機(jī)制研究
　　 研究背景和目的：
　　 肝細(xì)胞癌(Hepatocellular Carcinoma，HCC)是肝癌中最常見(jiàn)的類(lèi)型，占所有原位肝癌病例的90％以上。研究表明，慢性炎性反應(yīng)與肝癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。我國(guó)肝癌患者大多伴有長(zhǎng)期慢性病毒感染及大量免疫細(xì)胞侵潤(rùn)，因此腫瘤不同部位免疫微環(huán)境與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。巨噬細(xì)胞具有高度

2、的可塑性，不同的環(huán)境因素刺激呈現(xiàn)不同的表型。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAMs)是腫瘤組織中浸潤(rùn)的巨噬細(xì)胞，是腫瘤微環(huán)境中侵潤(rùn)的炎性細(xì)胞的最主要成分。研究表明腫瘤細(xì)胞通過(guò)分泌細(xì)胞因子、趨化因子等(如CSF1、MCP-1)從外周血中募集單核細(xì)胞到達(dá)腫瘤局部，誘導(dǎo)分化形成TAMs。TAMs的活化類(lèi)似于巨噬細(xì)胞的選擇性激活(alternative activation，M2-1ike)。臨床樣本分析發(fā)現(xiàn)，多種腫瘤組織中TAMs的密度與腫瘤預(yù)后密切相關(guān)

3、，如肝癌、乳腺癌、黑色素瘤等。進(jìn)一步研究認(rèn)為:TAMs在腫瘤細(xì)胞的增殖、存活、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移中起重要作用。但是也有研究指出，腫瘤癌旁組織中巨噬細(xì)胞呈現(xiàn)類(lèi)似經(jīng)典激活的表型(classical activation，Ml-like)，并通過(guò)促進(jìn)血管新生等機(jī)制促進(jìn)腫瘤發(fā)展。目前，巨噬細(xì)胞作為腫瘤間質(zhì)的重要組成部分，其對(duì)腫瘤局部微環(huán)境調(diào)節(jié)的分子機(jī)制逐漸成為研究的熱點(diǎn)。
　　 信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白α(SIRPα)是一類(lèi)廣泛表達(dá)的糖蛋白分子，屬于免疫球

4、蛋白超家族結(jié)構(gòu)域。SIRPα在免疫細(xì)胞中特異表達(dá)在巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞等髓系細(xì)胞表面。SIRPα的胞內(nèi)段含有富含酪氨酸的免疫抑制性基序(ITIMs)，在多種刺激下發(fā)生磷酸化并與下游分子SHP1/SHP2結(jié)合，調(diào)節(jié)信號(hào)的強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間。研究表明SIRPα參與維持小鼠T細(xì)胞與NK細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)，我們實(shí)驗(yàn)室先前發(fā)現(xiàn)SIRPα負(fù)性調(diào)節(jié)Toll受體介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞固有免疫，提示SIRPα參與了機(jī)體免疫系統(tǒng)的發(fā)育與免疫細(xì)胞的活化。
　　 目前關(guān)于

5、SIRPα在巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤免疫中的作用機(jī)制尚未見(jiàn)報(bào)道。我們發(fā)現(xiàn)單核/巨噬細(xì)胞SIRPα的表達(dá)水平在肝癌患者與正常人外周血中無(wú)明顯差異，但在肝癌癌旁組織中表達(dá)明顯降低，而在肝癌癌巢組織中呈現(xiàn)一定水平的恢復(fù)。體外研究表明肝癌細(xì)胞誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞SIRPα的表達(dá)水平明顯下調(diào)。以上結(jié)果提示SIRPα對(duì)腫瘤微環(huán)境誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞激活可能存在調(diào)節(jié)作用。為了解SIRPα在巨噬細(xì)胞腫瘤免疫中的作用和機(jī)制，本課題通過(guò)siRNA轉(zhuǎn)染或慢病毒感染干擾小鼠骨髓來(lái)

6、源巨噬細(xì)胞(BMDMs)中SIRPα的表達(dá)，利用共培養(yǎng)研究體系，探討了SIRPα對(duì)肝癌細(xì)胞誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞活化的影響，全面探討了SIRPα對(duì)巨噬細(xì)胞表型、遷移和存活的調(diào)節(jié)，并探討SIRPα對(duì)腫瘤誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞PI3K-Akt和NF-κB等信號(hào)通路活化的影響。為進(jìn)一步探討SIRPα對(duì)腫瘤進(jìn)程的調(diào)節(jié)，本課題通過(guò)小鼠體內(nèi)回輸差異表達(dá)SIRPα的巨噬細(xì)胞，利用不同的小鼠荷瘤模型，研究巨噬細(xì)胞SIRPα對(duì)腫瘤體內(nèi)生長(zhǎng)的影響，并進(jìn)一步探討SIRPα發(fā)

7、揮上述作用的可能機(jī)制，確定了SIRPα在腫瘤微環(huán)境中巨噬細(xì)胞功能調(diào)節(jié)中的重要地位，為腫瘤的治療提供新策略和新思路。
　　 實(shí)驗(yàn)方法：
　　 1.收集臨床肝癌患者新鮮腫瘤與癌旁組織樣本以及肝癌患者與正常健康人的外周血樣本，通過(guò)消化與密度梯度離心方法分離獲得單核/巨噬細(xì)胞，利用流式細(xì)胞檢測(cè)單核/巨噬細(xì)胞中SIRPα的表達(dá)。結(jié)合患者臨床資料，統(tǒng)計(jì)分析腫瘤組織巨噬細(xì)胞SIRPα的表達(dá)、癌旁組織巨噬細(xì)胞SIRPα的表達(dá)、腫瘤/癌旁

8、組織巨噬細(xì)胞SIRPα的表達(dá)與腫瘤臨床資料的相關(guān)性。
　　 2.C57BL/6來(lái)源的小鼠肝癌細(xì)胞系Hepal-6皮下接種同系小鼠，成瘤后分離小鼠外周血及腫瘤組織中單核/巨噬細(xì)胞，檢測(cè)SIRPα的表達(dá);Balb/c來(lái)源的小鼠肝癌細(xì)胞H22腹腔接種同系小鼠，待成瘤后檢測(cè)外周血及腹水中單核/巨噬細(xì)胞SIRPα的表達(dá)。
　　 3.誘導(dǎo)培養(yǎng)小鼠骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞(BMDMs)，利用transwell共培養(yǎng)體系（0.4μm），檢測(cè)肝癌

9、細(xì)胞對(duì)巨噬細(xì)胞SIRPα表達(dá)的調(diào)節(jié)及巨噬細(xì)胞活化標(biāo)志(MHCⅡ、細(xì)胞因子表達(dá))等;通過(guò)H2O2、缺氧等各種刺激模擬腫瘤微環(huán)境，檢測(cè)巨噬細(xì)胞SIRPα的表達(dá)。
　　 4.合成并鑒定具有特異干擾效果的siRNA或包裝慢病毒，干擾巨噬細(xì)胞SIRPα、SHP2的表達(dá)。
　　 5.利用transwell共培養(yǎng)體系（0.4μm），采用ELISA、Real-time PCR等方法檢測(cè)差異表達(dá)SIRPα的巨噬細(xì)胞在腫瘤細(xì)胞刺激下細(xì)胞因子

10、（如TNFα、IL6、IL10、IL12等）表達(dá)和分泌的變化。
　　 6.運(yùn)用特異磷酸化抗體檢測(cè)SIRPα對(duì)巨噬細(xì)胞Stat3、NF-κB、PI3K-Akt等信號(hào)通路活化的作用;利用熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)NF-κB和iNOS的轉(zhuǎn)錄活性。
　　 7.利用transwell遷移體系(5.0μm)，檢測(cè)差異表達(dá)SIRPα的巨噬細(xì)胞向腫瘤細(xì)胞遷移能力的差別;利用CMFDA標(biāo)記巨噬細(xì)胞體內(nèi)檢測(cè)SIRPα對(duì)巨噬細(xì)胞遷移至腫瘤組織的

11、能力的影響。
　　 8.檢測(cè)SIRPα表達(dá)對(duì)MCP-1、CSF1誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞遷移能力的調(diào)節(jié);利用特異性磷酸化抗體檢測(cè)PLCγ、Rac等遷移相關(guān)信號(hào)分子的活化。
　　 9.利用TNFα+CHX、TRAIL等刺激模擬腫瘤微環(huán)境中存在的促凋亡因子誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞發(fā)生凋亡，檢測(cè)SIRPα對(duì)巨噬細(xì)胞在不利刺激下凋亡水平的調(diào)節(jié)。
　　 10.采用清除體內(nèi)巨噬細(xì)胞再靜脈輸入巨噬細(xì)胞的方法獲得體內(nèi)具有不同SIRPα表達(dá)水平的巨噬細(xì)

12、胞的C57BL/6小鼠，將C57L來(lái)源的小鼠肝癌細(xì)胞系Hepa1-6通過(guò)皮下荷瘤或原位荷瘤等方法接種小鼠，觀察腫瘤的體內(nèi)生長(zhǎng)差異;采用同樣的方法獲得具有不同SIRPα表達(dá)水平的巨噬細(xì)胞的Balb/c小鼠，將Balb/c來(lái)源的H22細(xì)胞通過(guò)腹腔注射的方法接種小鼠，觀察腫瘤的生長(zhǎng)差異，記錄不同組小鼠的荷瘤生存時(shí)間。
　　 11.檢測(cè)差異表達(dá)SIRPα的巨噬細(xì)胞對(duì)腫瘤微環(huán)境的調(diào)節(jié):收集上述小鼠的Hepa1-6腫瘤樣本，通過(guò)Real-t

13、ime PCR等方法檢測(cè)腫瘤組織中炎性因子(TNFα、IL6、VEGF等)的表達(dá)水平;收集H22荷瘤小鼠的腹水，ELISA檢測(cè)腹水中炎性因子的分泌水平。
　　 12.采用免疫組化的方法檢測(cè)具有不同SIRPα表達(dá)水平的巨噬細(xì)胞的小鼠腫瘤樣本中血管新生的差異;通過(guò)Western-blot和熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)SIRPα對(duì)巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的血管新生相關(guān)信號(hào)通路HIF1α-NFAT-COX2-VEGF的調(diào)節(jié)。
　　 13.采用免

14、疫共沉淀的方法確定SIRPα與SHP2的相互作用及與SHP2相互作用的蛋白。
　　 14.采用瞬時(shí)干擾SHP2后檢測(cè)其對(duì)腫瘤誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞釋放細(xì)胞因子和信號(hào)通路磷酸化的調(diào)節(jié)，確定SHP2在巨噬細(xì)胞活化中的作用。
　　 15.采用免疫共沉淀的方法檢測(cè)SIRPα的不同表達(dá)是否影響SHP2與下游相互作用蛋白的結(jié)合。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　 1.SIRPα在腫瘤患者中的表達(dá):單核/巨噬細(xì)胞SIRPα的表達(dá)水平在肝

15、癌患者與正常人外周血中無(wú)明顯差異，但在肝癌癌旁組織中表達(dá)明顯降低，而在肝癌癌巢組織中呈現(xiàn)一定水平的恢復(fù)。體外研究表明肝癌細(xì)胞誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞SIRPα的表達(dá)水平明顯下調(diào)。
　　 2.SIRPα在小鼠肝癌荷瘤樣本中的表達(dá):與正常小鼠相比，荷瘤小鼠外周血單核/巨噬細(xì)胞SIRPα的表達(dá)無(wú)明顯差異;Hepa1-6荷瘤小鼠腫瘤組織及H22腫瘤腹水中巨噬細(xì)胞SIRPα的表達(dá)明顯低于相應(yīng)的小鼠外周血單核細(xì)胞。
　　 3.腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)巨噬細(xì)

16、胞SIRPα表達(dá)下調(diào):與正常培養(yǎng)及小鼠原代肝細(xì)胞共培樣的巨噬細(xì)胞相比，腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞SIRPα表達(dá)早期快速下調(diào)，并伴隨著巨噬細(xì)胞的活化（MHCⅡ表達(dá)升高、細(xì)胞因子釋放）;與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)較長(zhǎng)時(shí)間(5天)后，巨噬細(xì)胞SIRPα表達(dá)恢復(fù)，并伴隨巨噬細(xì)胞免疫抑制表型(MHCⅡ表達(dá)下降、細(xì)胞因子釋放減少)。
　　 4.腫瘤微環(huán)境中的因子參與誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞SIRPα的下調(diào):腫瘤微環(huán)境中的炎性因子如TNFα、缺氧、高ROS水平(H2O2

17、)等刺激能誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞SIRPα表達(dá)的下調(diào);利用特異性中和TNFα的抗體能部分抑制腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞SIRPα表達(dá)的下調(diào)。
　　 5.腫瘤微環(huán)境引起巨噬細(xì)胞SIRPα表達(dá)下調(diào)的機(jī)制:巨噬細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)不同的時(shí)間點(diǎn)，Real-time PCR檢測(cè)巨噬細(xì)胞SIRPα的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)腫瘤微環(huán)境可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞SIRPα轉(zhuǎn)錄水平的下降。利用不同的蛋白酶體和溶酶體抑制劑處理巨噬細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)腫瘤誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞SIRPα蛋白水平的下調(diào)

18、部分通過(guò)溶酶體介導(dǎo)的蛋白降解途徑參與。
　　 6.SIRPα調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中的表型:細(xì)胞因子、信號(hào)分子檢測(cè)的結(jié)果表明，SIRPα抑制腫瘤誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎性因子TNFα、 IL6的釋放和免疫抑制因子IL10的表達(dá);進(jìn)一步研究表明SIRPα抑制巨噬細(xì)胞Arg1的表達(dá)，促進(jìn)NOS2的表達(dá);此外，SIRPα抑制腫瘤誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞NF-κB和Stat3的活化，促進(jìn)Stat1的磷酸化。
　　 7.SIRPα調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞向腫

19、瘤細(xì)胞遷移:體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)表明SIRPα顯著抑制巨噬細(xì)胞向腫瘤細(xì)胞的遷移;此外SIRPα顯著抑制MCP-1、CSF1誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞遷移及相應(yīng)信號(hào)分子PLCγ和Rac的活化。
　　 8.SIRPα調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中的存活:低表達(dá)SIRPα的巨噬細(xì)胞在促凋亡信號(hào)刺激下的細(xì)胞凋亡水平明顯受到抑制;SIRPα抑制細(xì)胞存活相關(guān)信號(hào)PI3K-Akt的活化。
　　 9.巨噬細(xì)胞SIRPα的表達(dá)對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的影響:采用清除體內(nèi)巨噬細(xì)胞

20、再靜脈輸入巨噬細(xì)胞的方法獲得體內(nèi)具有不同SIRPα表達(dá)水平的巨噬細(xì)胞的C57BL/6小鼠，將C57L來(lái)源的小鼠肝癌細(xì)胞系Hepa1-6通過(guò)皮下荷瘤或原位荷瘤等方法接種小鼠，發(fā)現(xiàn)干擾SIRPα表達(dá)的巨噬細(xì)胞顯著促進(jìn)腫瘤的體內(nèi)生長(zhǎng);采用同樣的方法獲得具有不同SIRPα表達(dá)水平的巨噬細(xì)胞的Balb/c小鼠，將Balb/c來(lái)源的H22細(xì)胞通過(guò)腹腔注射的方法接種小鼠，發(fā)現(xiàn)干擾SIRPα表達(dá)的巨噬細(xì)胞明顯縮短了小鼠的生存時(shí)間。
　　 10.

21、巨噬細(xì)胞SIRPα的表達(dá)對(duì)腫瘤微環(huán)境的重構(gòu)的調(diào)節(jié):通過(guò)Real-time PCR和ELISA方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)低表達(dá)SIRPα的巨噬細(xì)胞促進(jìn)腫瘤微環(huán)境中炎性因子的表達(dá)。此外，低表達(dá)SIRPα的巨噬細(xì)胞促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和Stat3及NF-κB信號(hào)通路的活化。
　　 11.巨噬細(xì)胞SIRPα的表達(dá)對(duì)腫瘤血管新生的調(diào)節(jié):免疫組化染色發(fā)現(xiàn)低表達(dá)SIRPα的巨噬細(xì)胞促進(jìn)腫瘤血管新生;進(jìn)一步研究顯示腫瘤微環(huán)境中低表達(dá)SIRPα的巨噬細(xì)胞其血管新

22、生相關(guān)通路HIF1α-NFAT-COX2-VEGF明顯增強(qiáng)。
　　 12.SIRPα調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中巨噬細(xì)胞功能的機(jī)制:腫瘤細(xì)胞刺激巨噬細(xì)胞后可以發(fā)現(xiàn)SIRPα發(fā)生磷酸化，SIRPα磷酸化后可與SHP2和PI3K激酶調(diào)節(jié)亞基PI3Kp85結(jié)合;瞬時(shí)干擾SHP2表達(dá)后可見(jiàn)SHP2正性調(diào)節(jié)腫瘤誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞NF-κB和PI3K-Akt信號(hào)通路活化及相應(yīng)炎性因子的表達(dá);進(jìn)一步研究表明SIRPα對(duì)巨噬細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用部分通過(guò)SHP2發(fā)揮作

23、用的，SIRPα低表達(dá)顯著提高SHP2與IKKβ的結(jié)合，促進(jìn)IKK復(fù)合物的活化和NF-κB信號(hào)通路的激活;進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)SIRPα低表達(dá)顯著增強(qiáng)SHP2與PI3Kp85的結(jié)合，增強(qiáng)PI3K催化亞基PI3Kp110的活性。所以SIRPα可能通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性抑制SHP2與IKKs和PI3Kp85亞基的結(jié)合，抑制巨噬細(xì)胞NF-κB和PI3K-Akt信號(hào)通路活化。
　　 結(jié)論：
　　 本研究從分子-細(xì)胞-動(dòng)物-臨床水平全面深入研究了信

24、號(hào)調(diào)節(jié)蛋白α對(duì)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)作用和分子機(jī)制。本課題研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞通過(guò)分泌可溶性因子等方式誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞SIRPα表達(dá)下調(diào)，促進(jìn)巨噬細(xì)胞遷移至腫瘤局部并增強(qiáng)其在腫瘤微環(huán)境中存活的能力;低表達(dá)SIRPα的巨噬細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中分泌炎性因子及血管新生因子的能力顯著增強(qiáng)，參與促腫瘤微環(huán)境的重構(gòu)，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的發(fā)展，形成正反饋調(diào)節(jié)通路。因此，腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞SIRPα表達(dá)下調(diào)可能是腫瘤促進(jìn)自身發(fā)生發(fā)展的重要途徑。本課題還深入討論

25、了SIRPα調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞相關(guān)信號(hào)通路的作用機(jī)制，證明其可能通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)抑制SHP2與IKKs復(fù)合物和PI3K復(fù)合物相結(jié)合發(fā)揮調(diào)控作用。
　　 第二部分、信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白α(SIRPα)負(fù)性調(diào)節(jié)IgE誘導(dǎo)的肥大細(xì)胞活化
　　 研究背景及目的：
　　 目前過(guò)敏性疾病的發(fā)病率顯著上升，Ⅰ型超敏反應(yīng)就是其中一種重要的類(lèi)型。Ⅰ型超敏反應(yīng)發(fā)病突然，迅速引起機(jī)體損傷，嚴(yán)重時(shí)可能威脅生命。能夠致敏的抗原性物質(zhì)在自然界廣泛存在，可以經(jīng)呼吸

26、道消化道或皮膚接觸等途徑進(jìn)入體內(nèi)，刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抗原特異性免疫球蛋白E(IgE)。IgE分子可以與效應(yīng)細(xì)胞表面受體FcεRI穩(wěn)定結(jié)合，當(dāng)特異抗原再次進(jìn)入體內(nèi)，可以同IgE分子結(jié)合并且使相鄰的FcεRI交聯(lián)，引起細(xì)胞活化。FcεRI是由α鏈、β鏈和兩條γ鏈組成的四聚體。FcεRIα鏈含有配體結(jié)合鏈， IgE的Fc段結(jié)合后，募集激活β鏈和γ鏈的ITAM區(qū)，使ITAM發(fā)生磷酸化并介導(dǎo)下游信號(hào)傳遞。肥大細(xì)胞是Ⅰ型超敏反應(yīng)的重要效應(yīng)細(xì)胞，主

27、要通過(guò)脫顆粒和分泌炎性因子等發(fā)揮其生物學(xué)作用。
　　 免疫細(xì)胞的激活及免疫反應(yīng)的強(qiáng)度和范圍受到多種機(jī)制調(diào)節(jié)，目前認(rèn)為，免疫反應(yīng)正性和負(fù)性信號(hào)的平衡是維持機(jī)體免疫穩(wěn)態(tài)的主要方式。免疫反應(yīng)的負(fù)性信號(hào)就包括抑制性受體介導(dǎo)的信號(hào)調(diào)控。信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白家族(SIRP)就是一類(lèi)細(xì)胞表面的抑制性受體。信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白α(signal regulatory proteinα，SIRPα)屬于免疫球蛋白受體超家族，SIRPα主要表達(dá)在神經(jīng)元細(xì)胞及髓系來(lái)源

28、細(xì)胞，如肥大細(xì)胞。SIRPα胞外區(qū)具有三個(gè)IgSF樣結(jié)構(gòu)域和多個(gè)糖基化位點(diǎn)，胞內(nèi)區(qū)帶有免疫受體酪氨酸抑制基序(ITIMs)，能夠發(fā)生磷酸化并募集信號(hào)分子，目前研究表明，SIRPα的下游分子主要包括SHP-1和SHP-2。
　　 SIRPα對(duì)肥大細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)尚未見(jiàn)系統(tǒng)性報(bào)道。我們研究發(fā)現(xiàn)IgE-DNP介導(dǎo)的肥大細(xì)胞激活后SIRPα表達(dá)水平下降，提示SIRPα對(duì)肥大細(xì)胞活化可能存在抑制作用。為進(jìn)一步了解SIRPα在肥大細(xì)胞活化過(guò)程

29、中的作用，本課題通過(guò)通過(guò)差異表達(dá)SIRPα的肥大細(xì)胞研究了SIRPα在抗原誘導(dǎo)肥大細(xì)胞活化中的作用。
　　 實(shí)驗(yàn)方法：
　　 1.分離培養(yǎng)小鼠骨髓來(lái)源肥大細(xì)胞(BMMCs)，合成鑒定具有特異干擾SIRPα表達(dá)的siRNA，瞬時(shí)干擾BMMCs SIRPα的表達(dá);利用大鼠肥大細(xì)胞系RBL-2H3，建立穩(wěn)定高表達(dá)Myc-SIRPα和轉(zhuǎn)染空載體對(duì)照的細(xì)胞系;
　　 2.檢測(cè)肥大細(xì)胞活化后β-氨基己糖胺酶的釋放，研究體外S

30、IRPα對(duì)肥大細(xì)胞脫顆粒的調(diào)節(jié);
　　 3.利用肥大細(xì)胞缺失小鼠（c-kitwsh/wsh），重構(gòu)肥大細(xì)胞系統(tǒng)，進(jìn)行被動(dòng)皮膚過(guò)敏反應(yīng)，體內(nèi)觀察SIRPα對(duì)肥大細(xì)胞脫顆粒的調(diào)節(jié);
　　 4.肥大細(xì)胞脫顆粒與細(xì)胞骨架重排密切相關(guān)，采用熒光探針檢測(cè)SIRPα對(duì)細(xì)胞骨架F-actin聚合的調(diào)節(jié);檢測(cè)SIRPα對(duì)細(xì)胞微管形成的影響;
　　 5.細(xì)胞骨架重排與胞內(nèi)鈣離子流動(dòng)有關(guān)，使用Ca+指示劑檢測(cè)SIRPα對(duì)抗原引起肥大活

31、化過(guò)程中Ca2+流動(dòng)的調(diào)節(jié);
　　 6.檢測(cè)SIRPα對(duì)肥大細(xì)胞活化后細(xì)胞因子表達(dá)分泌的調(diào)節(jié);
　　 7.檢測(cè)SIRPα對(duì)肥大細(xì)胞活化MAPK、NFAT等信號(hào)通路的調(diào)節(jié);
　　 8.檢測(cè)SIRPα調(diào)節(jié)肥大細(xì)胞活化的分子機(jī)制。
　　 結(jié)果：
　　 1.SIRPα參與抗原誘導(dǎo)的肥大細(xì)胞活化過(guò)程:肥大細(xì)胞活化過(guò)程中SIRPα表達(dá)降低，并呈現(xiàn)抗原劑量與時(shí)間依賴(lài)性。SIRPα發(fā)生磷酸化并募集SHP-1和SH

32、P-2。
　　 2.SIRPα調(diào)節(jié)肥大細(xì)胞活化后脫顆粒:SIRPα顯著抑制體外肥大細(xì)胞脫顆粒和體內(nèi)PCA反應(yīng)引起的血管滲出;
　　 3.SIRPα抑制肥大細(xì)胞活化過(guò)程中的細(xì)胞骨架改變:SIRPα抑制肥大細(xì)胞活化過(guò)程中tubulin聚合及F-actin解聚;
　　 4.SIRPα抑制肥大細(xì)胞Ca2+釋放，提示SIRPα能夠通過(guò)調(diào)節(jié)Ca2+釋放影響肥大細(xì)胞骨架改變及脫顆粒過(guò)程;此外SIRPα明顯抑制Rac-1 GTP

33、ase的活性，進(jìn)而抑制了微管的形成。
　　 5.SIRPα抑制肥大細(xì)胞細(xì)胞因子合成分泌:抗原誘導(dǎo)的肥大細(xì)胞活化過(guò)程中，SIRPα通過(guò)抑制MAPK信號(hào)通路磷酸化以及轉(zhuǎn)錄因子NFκB和NFAT活性，抑制肥大細(xì)胞由抗原誘導(dǎo)的炎性因子合成與分泌。
　　 6.SIRPα在抗原誘導(dǎo)的肥大細(xì)胞活化過(guò)程中發(fā)揮負(fù)性調(diào)節(jié)作用的機(jī)制:肥大細(xì)胞活化引起SIRPα發(fā)生磷酸化。隨后SIRPα通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合SHP-2，影響SHP-2與PI3Kp85及I