RpoE在傷寒沙門菌克服環(huán)境高滲應(yīng)激中的基因表達(dá)調(diào)節(jié)機(jī)制研究.pdf

1、傷寒沙門菌(Salmonella enterica serovar Typhi，S.Typhi)是一種重要的人類腸道致病菌，是目前研究最為廣泛和深入的原核生物之一。傷寒沙門菌常通過污染食物經(jīng)消化道入體內(nèi)，在空腸遠(yuǎn)端入侵腸上皮細(xì)胞，并進(jìn)一步在局部腸系膜淋巴組織中存活和增殖，再經(jīng)淋巴液和血液進(jìn)入肝、脾等全身組織，造成全身性感染并能引發(fā)腸穿孔等嚴(yán)重的并發(fā)癥從而危及患者生命。
　　 作為人類食源性致病菌，傷寒沙門菌在從環(huán)境到使宿主致病的

2、過程中，需要遇到一系列劇烈的環(huán)境應(yīng)激，包括人的腸道高滲應(yīng)激環(huán)境。在高滲應(yīng)激條件下，細(xì)菌需要及時(shí)有效地調(diào)節(jié)某些基因的表達(dá)和蛋白的活性來適應(yīng)環(huán)境。原核生物基因表達(dá)均是由sigma因子介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄起始，且多數(shù)呈操縱子模式，并受各種調(diào)節(jié)因子的影響。不同的sigma因子(σ因子)特異性識(shí)別并引導(dǎo)RNA聚合酶結(jié)合到目的基因啟動(dòng)子區(qū)域，啟動(dòng)相應(yīng)基因表達(dá)，無疑是原核生物對(duì)其生命活動(dòng)進(jìn)行調(diào)控的最基本的方式。已知不同的sigma因子的作用不同，不同的sigma

3、因子對(duì)某些基因或有共調(diào)節(jié)作用，但缺乏直接的研究證據(jù)。RpoE是響應(yīng)環(huán)境應(yīng)激的sigma因子。已有研究發(fā)現(xiàn)RpoE是腸桿菌科細(xì)菌中一個(gè)重要的sigma因子，在響應(yīng)多種環(huán)境應(yīng)激時(shí)發(fā)揮著重要作用，對(duì)細(xì)菌生存和致病性至關(guān)重要，但其在傷寒沙門菌中作用的研究報(bào)道尚少。
　　 目的：本研究旨在了解與RpoE相關(guān)的參與傷寒沙門菌克服高滲應(yīng)激的效應(yīng)蛋白基因，深入分析RpoE對(duì)重要致病因子表達(dá)調(diào)控的機(jī)制，研究RpoE在傷寒沙門菌克服高滲應(yīng)激過程中與

4、另一sigma因子RpoS對(duì)基因表達(dá)的共調(diào)節(jié)作用，以加深對(duì)傷寒沙門菌基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和致病分子機(jī)制的認(rèn)識(shí)。
　　 方法：
　　 (1)基因缺陷變異株的制備采用自殺質(zhì)粒pGMB151介導(dǎo)的同源重組方法，制備傷寒沙門菌rpoS缺陷變異株及rpoE/rpoS雙缺陷變異株。
　　 (2)rpoE基因缺陷回補(bǔ)株的構(gòu)建PCR擴(kuò)增rpoE基因，酶切后與表達(dá)載體pBAD/gⅢ定向連接，熱擊法轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α中篩選陽性質(zhì)粒，經(jīng)

5、序列分析鑒定后，電擊法轉(zhuǎn)入rpoE基因缺陷變異株。
　　 (3)高滲應(yīng)激下生長(zhǎng)情況分析以生長(zhǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，細(xì)菌OD600值為縱坐標(biāo)繪制生長(zhǎng)曲線，對(duì)比缺陷變異株、野生株及基因缺陷回補(bǔ)株在高滲應(yīng)激條件下的生長(zhǎng)情況。
　　 (4)動(dòng)力試驗(yàn)分析缺陷變異株和野生株37℃培養(yǎng)過夜，分別取4μl菌液接種于0.3％高滲半固體LB培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)8小時(shí)后測(cè)量動(dòng)力圈直徑，觀察缺陷株及野生株的動(dòng)力。
　　 (5)傷寒沙門菌基因表達(dá)譜

6、分析傷寒沙門菌全基因組芯片分析目的基因在轉(zhuǎn)錄水平上對(duì)其他基因的表達(dá)調(diào)控。體外模擬高滲環(huán)境應(yīng)激后分別提取傷寒沙門菌野生株和基因缺陷變異株的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA并標(biāo)記熒光(cy3或cy5)，與基因組芯片雜交，掃描后根據(jù)熒光信號(hào)分析各基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平，比較傷寒沙門菌野生株和基因缺陷變異株在高滲應(yīng)激早期的基因表達(dá)譜差異。
　　 (6)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)分析選擇基因芯片結(jié)果中部分差異表達(dá)基因，設(shè)計(jì)特異性引物，進(jìn)行反

7、轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)定量PCR，以驗(yàn)證DNA芯片分析結(jié)果。
　　 (7)蛋白質(zhì)二維電泳和質(zhì)譜分析高滲應(yīng)激后分別提取rpoE缺陷變異株和野生株的菌體蛋白和分泌蛋白。取適量蛋白進(jìn)行等點(diǎn)聚焦和SDS-PAGE電泳分離后，以考馬斯亮藍(lán)G-250染色后掃描成像，分析蛋白表達(dá)差異，選取明顯表達(dá)差異蛋白進(jìn)行質(zhì)譜分析；質(zhì)譜分析的肽指紋圖在www.mascot進(jìn)行比對(duì)。
　　 (8)Western免疫印跡分析分泌蛋白高滲應(yīng)激條件培養(yǎng)rpoE缺陷株、

8、野生株，利用三氯醋酸-丙酮法提取培養(yǎng)上清中的分泌蛋白，以抗H：z66多克隆抗體進(jìn)行Western免疫印跡分析rpoE缺陷株、野生株分泌Z66蛋白的差異。
　　 (9)凝膠阻滯試驗(yàn)根據(jù)傷寒沙門菌rpoE基因序列設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增rpoE基因片段，與表達(dá)載體pET-28a連接經(jīng)熱擊法轉(zhuǎn)化入大腸桿菌JM109，用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)RpoE蛋白，用鎳柱純化RpoE蛋白。根據(jù)傷寒沙門菌fliA基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，擴(kuò)增fliA基因啟動(dòng)子區(qū)域，

9、取2μg PCR產(chǎn)物與不同濃度的RpoE蛋白混合，加入相應(yīng)體積的GSM緩沖液，反應(yīng)總體積為20μl，30℃孵育15 min。選取真核生物DNA片段作為陰性對(duì)照，8％的丙烯酰胺膠電泳分離條帶，溴化乙錠染色。
　　 (10)HeLa細(xì)胞侵襲試驗(yàn)細(xì)菌培養(yǎng)至OD600為1.0，加入培養(yǎng)有HeLa細(xì)胞的24孔板中(MOI=20)，90 min后收集一部分細(xì)胞，加入裂解液，涂LB平板過夜培養(yǎng)，計(jì)細(xì)菌克隆數(shù)，代表細(xì)菌粘附細(xì)胞水平T0；另一部分

10、加入慶大霉素殺死胞外細(xì)菌，繼續(xù)培養(yǎng)90 min，裂解細(xì)胞后涂板過夜培養(yǎng)，計(jì)克隆數(shù)代表細(xì)菌的侵襲水平T90，用T90/T0的值代表細(xì)菌的侵襲力。
　　 結(jié)果：
　　 (1)研究用菌株制備經(jīng)PCR及序列分析證實(shí)成功構(gòu)建傷寒沙門菌rpoS基因缺陷變異株、rpoE/rpoS雙缺陷變異株；成功構(gòu)建pBAD-rpoE陽性重組載體，并成功將重組載體導(dǎo)入相應(yīng)的缺陷株中，制備成rpoE基因缺陷回補(bǔ)株。
　　 (2)生長(zhǎng)曲線分析結(jié)果

11、顯示rpoE基因缺陷變異株在高滲應(yīng)激條件下生長(zhǎng)能力明顯弱于野生株，在回補(bǔ)rpoE基因后得到明顯恢復(fù)；rpoS基因缺陷株在高滲應(yīng)激條件下生長(zhǎng)能力亦明顯弱于野生株，rpoE/rpoS雙缺陷變異株在高滲應(yīng)激條件下生長(zhǎng)能力均明顯弱于野生株和rpoE、rpoS單基因缺陷株。
　　 (3)高滲應(yīng)激下RpoE影響基因表達(dá)分析基因組芯片分析顯示，高滲應(yīng)激30分鐘后，rpoE基因缺陷株相比野生株有74個(gè)基因表達(dá)下調(diào)，56個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，選取其中部

12、份差異表達(dá)基因利用RT-PCR進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示所選基因表達(dá)變化與基因芯片分析結(jié)果基本一致，且在回補(bǔ)rpoE基因后表達(dá)得到明顯恢復(fù)。
　　 (4)高滲應(yīng)激下RpoE對(duì)蛋白表達(dá)影響的分析二維電泳、質(zhì)譜分析顯示，rpoE缺陷株與野生株相比18個(gè)菌體蛋白明顯有差異，質(zhì)譜分析鑒定包括有氨酰組氨酸二肽酶PepD、氨酰組氨酸二肽酶AspA等；分泌蛋白二維電泳后發(fā)現(xiàn)rpoE缺陷株與野生株相比有16個(gè)明顯差異點(diǎn)，質(zhì)譜分析鑒定包括NAD合成酶Na

13、dE，外膜蛋白OmpC等。
　　 (5)RpoE對(duì)鞭毛及動(dòng)力影響機(jī)制研究動(dòng)力試驗(yàn)結(jié)果顯示，在高滲半固體LB培養(yǎng)平板上，rpoE基因缺陷變異株動(dòng)力比野生株明顯下降，回補(bǔ)rpoE基因后動(dòng)力明顯恢復(fù)，提示RpoE在高滲條件下參與調(diào)控鞭毛動(dòng)力；結(jié)合高滲應(yīng)激早期基因芯片發(fā)現(xiàn)rpoE缺陷變異株中二級(jí)鞭毛基因fliA和三級(jí)鞭毛基因表達(dá)明顯下調(diào)，利用qRT-PCR分析一級(jí)鞭毛基因flhD、二級(jí)鞭毛基因fliA和三級(jí)鞭毛基因fljB：z66的表達(dá)

14、情況發(fā)現(xiàn)，rpoE缺陷變異株中flhD相比野生株沒有明顯差異，而fliA與fljB：z66的表達(dá)在rpoE缺陷變異株中明顯下調(diào)；Western-bolt發(fā)現(xiàn)鞭毛蛋白FljB：z66在rpoE缺陷變異株的表達(dá)明顯低于野生株；凝膠阻滯試驗(yàn)證實(shí)RpoE蛋白可以直接結(jié)合fliA基因啟動(dòng)子。
　　 (6)RpoE對(duì)傷寒沙門菌侵襲力影響分析 rpoE基因缺陷變異株的侵襲力比野生株明顯下降，而rpoE回補(bǔ)株侵襲能力明顯恢復(fù)；結(jié)合基因芯片結(jié)果，

15、挑選部分侵襲毒力相關(guān)基因進(jìn)行qRT-PCR，發(fā)現(xiàn)這些基因在rpoE缺陷株中表達(dá)相對(duì)野生株明顯下調(diào)，在回補(bǔ)rpoE基因后表達(dá)明顯恢復(fù)。
　　 (7)高滲應(yīng)激下RpoE和RpoS對(duì)基因表達(dá)的共調(diào)節(jié)分析利用基因組芯片，進(jìn)一步分析rpoE基因缺陷株表達(dá)譜、rpoS基因缺陷株表達(dá)譜和rpoE/rpoS雙缺陷株表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)有38個(gè)基因，包括osmC、osmY、otsBA、narUZY、dpS等，在rpoE、rpoS缺陷株中相比野生株表達(dá)變化

16、不明顯，但在rpoE/rpoS雙缺陷株表達(dá)明顯下調(diào)，提示這些基因受RpoE與RpoS的雙重調(diào)控；選取不同操縱子的6個(gè)基因(osmC，osmY，otsB，narU，ugpB和dps)進(jìn)行qRT-PCR進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示，所選基因表達(dá)與基因芯片分析結(jié)果一致。
　　 結(jié)論：
　　 (1)RpoE在傷寒沙門菌高滲應(yīng)激時(shí)參與fliA、flgK、cheW、glpX、ompC、phoP等致病因子基因的表達(dá)調(diào)控。
　　 (2)高