2023年全國(guó)碩士研究生考試考研英語(yǔ)一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁(yè)
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文檔簡(jiǎn)介

1、食品是人類(lèi)生存和發(fā)展的基本需求之一,它提供人體生長(zhǎng)發(fā)育、維持生命以及進(jìn)行各種活動(dòng)所需的能量和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。食品與人們的生活息息相關(guān),因而食品的安全性對(duì)人類(lèi)健康就顯得至關(guān)重要。食品中微生物污染是食品安全最主要的問(wèn)題之一,如沙門(mén)菌對(duì)食品的污染而引起的食物中毒,即使在西方發(fā)達(dá)國(guó)家也有明顯上升的趨勢(shì)。沙門(mén)菌(Salmonella)是腸桿菌科(Enterobacteriaceae)的一個(gè)重要菌屬,為革蘭氏陰性,需氧或兼性厭氧,絕大部分有鞭毛,具有運(yùn)動(dòng)

2、性的桿狀細(xì)菌,是人類(lèi)研究最為廣泛和深入的食源性病原微生物。沙門(mén)菌主要棲息在動(dòng)物的腸道,隨糞便排出后就可污染其他周?chē)h(huán)境,污染的食品被人或動(dòng)物食用后,再經(jīng)過(guò)腸道、糞便繼續(xù)循環(huán),可通過(guò)食品或飼料的國(guó)際貿(mào)易而擴(kuò)大,這是沙門(mén)菌在世界范圍廣泛分布的主要原因。
   鞭毛(flagella)是細(xì)菌的動(dòng)力裝置,也是沙門(mén)菌的一種重要的毒性因子。鞭毛基因的表達(dá)調(diào)節(jié)在沙門(mén)菌的感染過(guò)程中,尤其是在侵襲過(guò)程中具有極其重要的作用,因此鞭毛缺損變異使沙門(mén)菌

3、的致病力大為降低。沙門(mén)菌的鞭毛具有極為豐富的多態(tài)性,通過(guò)血清學(xué)檢查,已有近100種不同鞭毛抗原被發(fā)現(xiàn),命名為a至z和zl至zN。沙門(mén)菌鞭毛抗原的多態(tài)性與基因的水平轉(zhuǎn)移和局部變異相關(guān)。據(jù)菌體和鞭毛抗原特性,已有2200多種沙門(mén)菌血清型被發(fā)現(xiàn)。大多數(shù)的血清型,如鼠傷寒沙門(mén)菌(S.Typhimurium)有兩相不同的鞭毛素編碼基因,分別位于染色體不同的部位,稱(chēng)之為Ⅱ相菌株。常以fliC和fljB分別表示Ⅰ相和Ⅱ相鞭毛素編碼基因。在沙門(mén)菌入侵宿

4、主的過(guò)程中,會(huì)激活宿主的免疫系統(tǒng)使機(jī)體產(chǎn)生抗體來(lái)應(yīng)付細(xì)菌的入侵,大部分沙門(mén)菌則可以通過(guò)改變抗原的表達(dá)來(lái)應(yīng)對(duì)這種抗體應(yīng)激。這種在鞭毛抗體存在的條件下,兩相沙門(mén)菌等可自行變換鞭毛抗原表達(dá)的特性稱(chēng)之為相變換(phase variation),這可能是細(xì)菌逃避宿主免疫監(jiān)控的機(jī)制之一。
   傷寒沙門(mén)菌(Salmonella enterica serovar Typhi,S.Typhi)是沙門(mén)菌屬中一種重要的人類(lèi)腸道致病菌,其通過(guò)污染食物

5、進(jìn)入消化道,克服胃酸、高滲腸液及腸道正常菌群的防御作用,在空腸遠(yuǎn)端侵入腸上皮M細(xì)胞,并能進(jìn)一步在局部腸系膜淋巴組織和吞噬細(xì)胞中存活和增殖,再經(jīng)淋巴液和血液系統(tǒng)進(jìn)入肝脾等組織,造成全身系統(tǒng)性感染-“傷寒”(typhoid fever)。傷寒沙門(mén)菌從環(huán)境至人體空腸的遠(yuǎn)端,需經(jīng)一系列調(diào)節(jié),如增加莢膜(Vi)抗原表達(dá)以克服劇烈胃酸環(huán)境影響,進(jìn)入腸道后減少莢膜抗原的表達(dá),增加鞭毛抗原與一些編碼基因位于沙門(mén)菌致病島Ⅰ(Salmonella Path

6、ogenic Island1,SPI-1)的侵襲因子的表達(dá),以協(xié)助細(xì)菌粘附于腸上皮M細(xì)胞,進(jìn)而侵入腸上皮組織。因此,在感染過(guò)程中傷寒沙門(mén)菌應(yīng)對(duì)各種不同環(huán)境應(yīng)激的自身調(diào)節(jié)極為重要。
   目的:
   長(zhǎng)期以來(lái)人們都認(rèn)為傷寒沙門(mén)菌為單相菌株,即只有Ⅰ相鞭毛素編碼基因fliC,其相應(yīng)的抗原為d抗原或j抗原(d抗原編碼基因的中央可變區(qū)缺損了261bp)。1981年Guinee首次在從印度尼西亞分離獲得的傷寒沙門(mén)菌菌株中發(fā)現(xiàn)一種

7、新的鞭毛抗原,命名為z66抗原。2004年我們首次成功地克隆了z66抗原的編碼基因fljB:z66,fljB:z66下游525-bp的ORF與鼠傷寒沙門(mén)菌等Ⅱ相沙門(mén)菌的fljA有較高的相似性,為fljA樣基因,最近我們也證實(shí)了該基因是一相鞭毛素基因fliC的抑制基因。在抗H:z66的鞭毛抗體存在條件下體外培養(yǎng),z66抗原陽(yáng)性傷寒沙門(mén)菌能改變鞭毛抗原的表達(dá),但這種變化與鼠傷寒沙門(mén)菌等的相變換不同,為單向不可逆變化,即只能從z66抗原表達(dá)轉(zhuǎn)

8、變?yōu)閐或i抗原的表達(dá)。最近有研究表明,z66抗原的編碼基因位于一罕見(jiàn)的線(xiàn)性質(zhì)粒中,而且這種單向相變換是與線(xiàn)性質(zhì)粒缺失變異有關(guān),但相關(guān)機(jī)制尚不明確。另外,我們也首次發(fā)現(xiàn)有兩株不同來(lái)源(日本和印度)的z66+傷寒沙門(mén)菌野生株有不同的鞭毛相變換表象,即在抗體誘導(dǎo)后其線(xiàn)性質(zhì)??砂l(fā)生部分和完全缺失的兩種不同現(xiàn)象。已有研究表明,鞭毛可作為鼠傷寒沙門(mén)菌的外部特殊感受器,感受環(huán)境濕度和溫度,發(fā)揮對(duì)自身鞭毛基因的表達(dá)調(diào)節(jié)作用。據(jù)此我們推測(cè),鞭毛與相應(yīng)的抗

9、體結(jié)合后,可以啟動(dòng)胞內(nèi)一系列基因表達(dá)調(diào)節(jié),最終通過(guò)某些關(guān)鍵基因的表達(dá)改變,致線(xiàn)性質(zhì)粒的缺失變異而實(shí)現(xiàn)單向性鞭毛表達(dá)的相變換。本文的目的是為了揭示鞭毛作為細(xì)菌外部特殊感受器介導(dǎo)胞內(nèi)基因的表達(dá)調(diào)控特性,并通過(guò)比較抗體誘導(dǎo)的菌株之間的基因組差異,深入探究z66+傷寒沙門(mén)菌鞭毛單向相變換確切的分子機(jī)制,為原核生物鞭毛可發(fā)揮特殊感受器的功能提供全新認(rèn)識(shí)。
   方法:
   (1)傷寒沙門(mén)菌鞭毛素基因fljB:z66的克隆表達(dá)及其

10、多克隆抗體的制備根據(jù)fljB:z66基因兩端序列設(shè)計(jì)引物,利用PCR技術(shù)從H:z66陽(yáng)性傷寒沙門(mén)菌基因組DNA中得到鞭毛素基因fljB:z66,將該基因克隆到表達(dá)載體pET-28a(+)上并在大腸桿菌JM109中進(jìn)行表達(dá);fljB:z66的表達(dá)產(chǎn)物FljB-his6經(jīng)Ni柱純化后作為抗原免疫兔以制備其多克隆抗體。
   (2)抗體誘導(dǎo)傷寒沙門(mén)菌鞭毛相變換及基因組結(jié)構(gòu)分析利用含抗H:z66抗體的半固體LB平板誘導(dǎo)本實(shí)驗(yàn)室保存的兩株

11、不同來(lái)源的H:z66陽(yáng)性的傷寒沙門(mén)菌,然后通過(guò)脈沖場(chǎng)凝膠電泳和Southern Blot等技術(shù)分析相變換前后細(xì)菌染色體結(jié)構(gòu)的變化。同時(shí),通過(guò)提取H:z66陽(yáng)性的傷寒沙門(mén)菌GIFU10007及其相變株j菌的線(xiàn)性質(zhì)粒,通過(guò)對(duì)其進(jìn)行DNA測(cè)序和酶切鑒定,分析相變換前后細(xì)菌線(xiàn)性質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)變化。
   (3)抗體脅迫下傷寒沙門(mén)菌鞭毛介導(dǎo)的基因表達(dá)調(diào)控分析傷寒沙門(mén)菌GIFU10007在兔抗H:z66多克隆抗體誘導(dǎo)30分鐘后,利用傷寒沙門(mén)菌全

12、基因組芯片分析技術(shù)分析其與正常對(duì)照血清誘導(dǎo)30分鐘后的傷寒沙門(mén)菌GIFU10007的基因表達(dá)譜的差異。用同樣的方法分析傷寒沙門(mén)菌GIFU10007的缺陷株△fljB:z66在兔抗H:z66多克隆抗體誘導(dǎo)30分鐘后的基因表達(dá)譜的變化作為無(wú)鞭毛的對(duì)照組實(shí)驗(yàn)。選擇部分表達(dá)差異顯著的有代表性的基因,設(shè)計(jì)并合成特異性引物,進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR,驗(yàn)證基因芯片的分析結(jié)果。
   (4)兩株具有不同相變換表象野生傷寒沙門(mén)菌(GIFU10007

13、和Ind-8)的全基因組結(jié)構(gòu)比較分析提取兩株鞭毛相變換表象不同H:z66陽(yáng)性傷寒沙門(mén)菌野生株的線(xiàn)性質(zhì)粒,通過(guò)PCR技術(shù)分析比較這兩株菌各自的線(xiàn)性質(zhì)粒的DNA序列差異;提取兩株H:z66陽(yáng)性傷寒沙門(mén)菌的基因組DNA,通過(guò)Solexa法測(cè)定這兩株傷寒沙門(mén)菌的全基因組DNA序列,分析比較它們的差異基因,以分析傷寒沙門(mén)菌鞭毛相變換的關(guān)健因子。
   結(jié)果:
   (1)經(jīng)PCR和酶切鑒定以及DNA測(cè)序證實(shí),傷寒沙門(mén)菌鞭毛素基因f

14、ljB:z66被成功導(dǎo)入表達(dá)載體pET-28a(+),并在大腸桿菌JM109中獲得了高效表達(dá),以此表達(dá)的蛋白作為抗原成功制備了兔抗z66的多克隆抗體。
   (2)本實(shí)驗(yàn)室保存的兩株不同來(lái)源的H:z66陽(yáng)性的傷寒沙門(mén)菌的基因fljB:z66均位于一罕見(jiàn)的線(xiàn)性質(zhì)粒中,在兔抗H:z66多克隆抗體的誘導(dǎo)下均成功發(fā)生了鞭毛抗原從表達(dá)z66至表達(dá)d/j的單向相變換,這種單向相變換是由于傷寒沙門(mén)菌在抗體誘導(dǎo)下線(xiàn)性質(zhì)粒缺失了含fljBA的2.

15、6 kb末端區(qū)域或線(xiàn)性質(zhì)粒的全部丟失所導(dǎo)致的。
   (3)傷寒沙門(mén)菌GIFU10007在抗H:z66抗體誘導(dǎo)30min后,187個(gè)基因的表達(dá)發(fā)生了3倍以上的明顯變化,其中有122個(gè)基因表達(dá)上調(diào),包括構(gòu)成核糖體的多種蛋白質(zhì)基因和參與轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)合成的多種因子等;同時(shí)也有65個(gè)基因在抗體誘導(dǎo)后表達(dá)下調(diào),其中包括多種代謝酶和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子基因等。實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR進(jìn)一步驗(yàn)證了基因芯片實(shí)驗(yàn)的部分結(jié)果與基因表達(dá)譜分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致

16、,表明在鞭毛抗體應(yīng)激下,傷寒沙門(mén)菌的鞭毛確實(shí)可以作為外部的感受器,介導(dǎo)大量的基因表達(dá)調(diào)節(jié)。
   (4)兩株在抗H:z66多克隆抗體的誘導(dǎo)下具有不同相變換表象的傷寒沙門(mén)菌其fljB:z66所在的線(xiàn)性質(zhì)粒DNA序列沒(méi)有明顯的差異。這兩株細(xì)菌的全基因組測(cè)序分析表明,共有628個(gè)基因具有顯著的差異,其中185個(gè)基因在傷寒沙門(mén)菌GIFU10007中沒(méi)有,只存在于H:z66陽(yáng)性傷寒沙門(mén)菌Ind-8野生株中,其余有差異的基因其DNA序列差異

17、都在40%以上。在這185個(gè)基因中,包括了多種參與DNA復(fù)制、修復(fù)、轉(zhuǎn)錄、調(diào)控和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的基因,以及編碼多種代謝酶和功能未知的蛋白基因。
   結(jié)論:
   (1)本文成功克隆了傷寒沙門(mén)菌鞭毛素基因fljB:z66,表達(dá)了其編碼蛋白Z66,并制備了兔抗Z66的多克隆抗體。
   (2)利用制備的兔抗H:z66的多克隆抗體,成功誘導(dǎo)了兩株不同來(lái)源的z66+傷寒沙門(mén)菌的鞭毛單向性相變換,同時(shí)還表明了兩株細(xì)菌的fljB

18、:z66基因位于一罕見(jiàn)的線(xiàn)性質(zhì)粒上,在抗H:z66的抗體的誘導(dǎo)下,線(xiàn)性質(zhì)粒會(huì)完全丟失和僅丟失含fljBA的2.6 kb末端區(qū)域不同的變化;
   (3)揭示了H:z66陽(yáng)性傷寒沙門(mén)菌的鞭毛可以作為一特殊感受器來(lái)介導(dǎo)胞內(nèi)基因的表達(dá)調(diào)控;
   (4)發(fā)現(xiàn)了兩株鞭毛相變換表象不同的H:z66陽(yáng)性傷寒沙門(mén)菌野生株,它們具有628個(gè)差異顯著的基因,其中某些基因可能是鞭毛相變換作用的關(guān)健因子,為進(jìn)一步深入研究傷寒沙門(mén)菌線(xiàn)性質(zhì)粒介導(dǎo)

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