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文檔簡介
1、目的:
OxyR作為細(xì)菌中的重要調(diào)控子,在面對氧化應(yīng)激時發(fā)揮重要作用,它可以幫助細(xì)菌抵御氧化損傷。OxyR在傷寒沙門菌中的調(diào)節(jié)機(jī)制還不是非常的全面,這次實(shí)驗(yàn)我們通過基因芯片的方法篩選受OxyR調(diào)節(jié)的基因,并對其中新發(fā)現(xiàn)的調(diào)控基因進(jìn)行了進(jìn)一步的研究。
方法:
1.傷寒沙門菌基因芯片分析oxyR對系統(tǒng)基因表達(dá)影響:
將傷寒沙門菌野生株和oxyR基因缺陷變異株(ΔoxyR)培養(yǎng)至OD6000.4,給予氧
2、應(yīng)激(4 mmol/L H2O2)20 min后,提取細(xì)菌總RNA,進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄并用熒光素Cy3-或Cy5-進(jìn)行互標(biāo)cDNA后,與S.Typhi基因組芯片雜交,掃描芯片并用軟件分析結(jié)果。
2.qRT-PCR檢測傷寒沙門菌oxyR對Vi莢膜抗原相關(guān)基因表達(dá)影響:
將傷寒沙門菌野生株、ΔoxyR、oxyR缺陷回補(bǔ)株(ΔoxyR+pBAD-oxyR)、oxR缺陷回補(bǔ)空質(zhì)粒株(ΔoxyR+pBAD)培養(yǎng)至OD6000.4,給予
3、氧應(yīng)激(4mmol/LH2O2)20 min或不給予氧應(yīng)激,提取細(xì)菌總RNA后,逆轉(zhuǎn)錄并進(jìn)行qRT-PCR。分析傷寒沙門菌各菌株中tviA、tviE、vexE的表達(dá)量。
3.酶免疫吸附法(ELISA)檢測傷寒沙門菌Vi莢膜抗原:
將傷寒沙門菌野生株、ΔoxyR、oxyR缺陷回補(bǔ)株(ΔoxyR+pBAD-oxyR)、oxyR缺陷回補(bǔ)空質(zhì)粒株(ΔoxyR+pBAD)各菌株培養(yǎng)至OD6000.4后,分別加入兔源抗Vi抗血清
4、和辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗進(jìn)行孵育,加入終止液終止反應(yīng)后,通過酶標(biāo)儀在450nm處檢測熒光強(qiáng)度來檢測菌株表面Vi抗原的表達(dá)量。
4.流式細(xì)胞術(shù)檢測傷寒沙門菌Vi莢膜抗原的表達(dá):
將傷寒沙門菌野生株、ΔoxyR、oxyR缺陷回補(bǔ)株(ΔoxyR+pBAD-oxyR)、oxyR缺陷回補(bǔ)空質(zhì)粒株(ΔoxyR+pBAD)各菌株培養(yǎng)至OD6000.4后,分別加入兔源抗Vi抗血清和FITC標(biāo)記的羊抗兔二抗進(jìn)行孵育,通過流式細(xì)
5、胞儀來檢測各傷寒沙門菌菌株表面Vi抗原的表達(dá)量。
5.傷寒沙門菌OxyRhis6蛋白的表達(dá)和純化:
將構(gòu)建成功的pET28a-oxyR重組載體熱擊入E.coli JM109(DE3),篩選出陽性菌株。將陽性菌株培養(yǎng)至OD6000.6后,加入IPTG誘導(dǎo),經(jīng)過誘導(dǎo)后的菌株,離心取其上清通過含Ni+的親和層析柱來收集和純化蛋白。
6.凝膠阻滯試驗(yàn):
將傷寒沙門菌中純化的OxyRhis6蛋白與含tviA
6、的啟動子區(qū)域DNA片段孵育,用6%丙烯酰胺膠電泳來檢測二者的結(jié)合情況。
結(jié)果:
1.基因芯片分析結(jié)果表明,ΔoxyR相對于野生株,有64個基因發(fā)生了變化,其中發(fā)生上調(diào)基因17個,下調(diào)基因47個,包括與Vi莢膜抗原表達(dá)相關(guān)的viaB簇基因。
2.qRT-PCR表明,在氧應(yīng)激和非氧應(yīng)激下,oxyR缺陷都可以使viaB基因簇的基因表達(dá)量發(fā)生下調(diào)。
3.酶免疫吸附法(ELISA)檢測表明,非氧條件下傷寒沙
7、門菌oxyR缺陷能使Vi莢膜抗原的表達(dá)量發(fā)生了下調(diào)。
4.流式細(xì)胞術(shù)檢測進(jìn)一步證實(shí)了在傷寒沙門菌中,非氧條件下oxyR可影響Vi莢膜抗原的表達(dá)。
5.通過原核表達(dá)成功獲取傷寒沙門菌OxyRhis6蛋白。
6.凝膠阻滯試驗(yàn)表明OxyRhis6蛋白與tviA的啟動子區(qū)域在體外無直接結(jié)合。
結(jié)論:
在傷寒沙門菌中,非氧條件下,oxyR基因的缺陷使得viaB基因簇的表達(dá)量發(fā)生了下降;同時,oxy
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