傷寒沙門菌基因組DNA芯片的制備與基因表達譜分析應(yīng)用研究.pdf

1、沙門菌屬(Salmonella)是研究較為廣泛的病原菌屬之一，其基因組結(jié)構(gòu)及近百分之六十的基因功能已被闡明，已成為一種重要的原核生物基因表達與信息調(diào)控研究的模式菌。傷寒沙門菌(S.entericaserovar Typhi)和鼠傷寒沙門菌(S.enterica serovar Typhimurium)是腸炎沙門菌(S.enterica)中最為重要的兩個致病性血清型，由于傷寒沙門菌是一種人類致病菌，無法實施有關(guān)感染和毒力學(xué)方面的活體實驗，

2、故至今，有關(guān)傷寒沙門菌的認(rèn)識大多來自于在鼠體內(nèi)引起類似傷寒熱的鼠傷寒沙門菌的研究。
　　 基因芯片技術(shù)的發(fā)展為全面、高效觀察基因表達提供了一個極佳的策略。運用全基因組芯片技術(shù)對原核生物基因表達譜分析已有許多報道，如基因表達譜分析，細(xì)胞分型，致病性分析，比較基因組學(xué)研究，藥物研發(fā)，腫瘤研究，疫苗的研發(fā)，及單核苷酸多態(tài)性分析等。目前，已有數(shù)百種微生物完成了全基因組序列測定，為全基因組DNA芯片的研制提供了豐富的基因序列信息，同時也為

3、該技術(shù)在微生物研究中的應(yīng)用提供了廣闊的空間。
　　 Stanford大學(xué)的研究人員在2003年首先建立了沙門菌基因組芯片，極大推動了有關(guān)基因表達譜和比較基因組學(xué)研究，由于西方發(fā)達國家鼠傷寒沙門菌感染較多，沙門菌基因組芯片應(yīng)用研究多集中于鼠傷寒沙門菌的研究?；蛐酒缓铣芍苽浼夹g(shù)誕生后，雖有多家公司相繼設(shè)計生產(chǎn)出各種Oligo基因組芯片，但目前價格仍然十分昂貴，在我國大規(guī)模應(yīng)用仍受到一定限制。
　　 另外，目前DNA芯片

4、基因表達譜研究的報道，多集中于真核生物，這是由于真核生物mRNA具有polyA尾，易于獲得。原核生物的基因表達譜研究也有報道，但因其mRNA無poly(A)序列等基本特征，只能通過提取總RNA的方式進行相關(guān)實驗，至今沒有一個統(tǒng)一的操作方法。
　　 傷寒沙門菌在感染人體的整個過程中，要遭遇多種不同的劇烈的環(huán)境脅迫，如胃部強酸，腸道的高滲和膽汁，網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞的高氧等。傷寒沙門菌必須啟動相應(yīng)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來對付這些不利的環(huán)境變化，從而

5、得以在人體內(nèi)生存并感染宿主細(xì)胞。原核生物中的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路通常由細(xì)胞膜上許多特殊的感受分子(sensor)與胞內(nèi)的效應(yīng)調(diào)節(jié)分子(response regulator)相偶聯(lián)構(gòu)成的雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)(two-component regulatory system)所介導(dǎo)。
　　 UhpB/UhpA是其中的一種非典型性雙組份調(diào)節(jié)系統(tǒng)，由細(xì)胞外葡萄糖-6-磷酸(G-6-P)啟動，與分解代謝基因激活蛋白一起，激活uhpT的轉(zhuǎn)錄。迄今為止，G-

6、6-P被認(rèn)為是激活UhpABC信號通路的唯一配體。意味著，到目前為止，UhpABC的已知功能僅在于幫助腸道菌利用G-6-P作為碳源和能源物質(zhì)。但是，本室前期基于DNA芯片的研究工作中，發(fā)現(xiàn)高滲應(yīng)激15分鐘后，野生型傷寒沙門菌的uhpA和uhpB基因均有所上調(diào)。據(jù)此推測，在高滲應(yīng)激下uhpA可能有未被認(rèn)知的功能。
　　 目的：
　　 1.制備傷寒沙門菌基因組DNA芯片，為低消耗、大規(guī)模地開展相關(guān)的基因表達譜分析和比較基因組

7、學(xué)研究提供了一個關(guān)健技術(shù)平臺；
　　 2.建立和優(yōu)化傷寒沙門菌基因組DNA芯片基因表達譜分析技術(shù)；
　　 3.敲除傷寒沙門菌uhpA基因獲得uhpA基因缺陷變異株；
　　 4.運用傷寒沙門菌全基因組DNA芯片基因表達譜分析技術(shù)來比較野生型傷寒沙門菌與uhpA基因缺陷變異株基因表達譜的差異以期獲得UhpA的潛在功能。
　　 方法：
　　 1.傷寒沙門菌基因組DNA芯片的制備：利用傷寒沙門菌現(xiàn)有的全基

8、因組序列，以Ty2菌株的基因組為基準(zhǔn)，選取CT18菌株和z66陽性菌株的特異性的蛋白編碼基因，設(shè)計特異性引物，經(jīng)PCR擴增，有效擴增產(chǎn)物純化后點樣于多聚賴氨酸玻片制備傷寒沙門菌基因組DNA芯片，并驗證芯片樣點位次與效果；
　　 2.傷寒沙門菌基因組DNA芯片基因表達譜分析技術(shù)的建立與優(yōu)化：本研究主要從RNA的提取、反應(yīng)體系、RNA用量、反轉(zhuǎn)錄酶用量、不同的引物及用量、熒光素用量、cDNA標(biāo)記及純化方法、雜交溫度及時間等方面對細(xì)菌

9、基因表達譜條件進行優(yōu)化。提取傷寒沙門菌野生z66陽性菌株總RNA，以六、九核苷酸隨機引物(N6、N9)和(或)基因組特異引物(GDP)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，用熒光素Cy5或Cy3直接摻入標(biāo)記后，與傷寒沙門菌全基因組芯片雜交，用芯片掃描儀掃描后經(jīng)過數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化處理后及統(tǒng)計分析，獲得表達譜分析結(jié)果。
　　 3.傷寒沙門菌uhpA基因缺陷變異株制備：采用自殺質(zhì)粒pGMB151介導(dǎo)的同源重組方法制備傷寒沙門菌調(diào)節(jié)因子UhpA的基因缺陷變異株

10、，根據(jù)傷寒沙門菌uhpA基因序列設(shè)計引物，擴增uhpA基因上、下游同源性片段，定向連接成uhpA基因缺損型同源核苷酸片段，并與自殺質(zhì)粒pGMB151相連后經(jīng)電擊法導(dǎo)入傷寒沙門菌野生株，在5％蔗糖LB平板上培養(yǎng)，誘導(dǎo)重組，通過篩選獲得完全重組的uhpA基因缺陷變異株；
　　 4.傷寒沙門菌基因轉(zhuǎn)錄表達譜分析：利用傷寒沙門菌全基因組芯片分析技術(shù)，體外模擬高滲環(huán)境應(yīng)激，在低滲(50mmol/L NaCl)LB培養(yǎng)液中分別培養(yǎng)傷寒沙門菌

11、野生株和uhpA基因缺陷變異株4h(37℃，250rpm)至對數(shù)生長期，后轉(zhuǎn)入高滲(300mmol/L NaCl)LB培養(yǎng)液中在同樣條件下繼續(xù)培養(yǎng)，在高滲應(yīng)激早期(30min)，分別提取傷寒沙門菌野生株和uhpA基因缺陷變異株的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA并標(biāo)記熒光(cy3或cy5)，與基因組芯片雜交，掃描后據(jù)熒光信號分析各基因轉(zhuǎn)錄表達水平，比較傷寒沙門菌野生株和uhpA基因缺陷變異株在高滲應(yīng)激后期的基因表達譜差異；
　　 5.實

12、時熒光定量PCR(qRT-PCR)分析：選擇部分表達差異顯著的基因，設(shè)計并合成特異性引物，進行實時熒光定量PCR，驗證DNA芯片分析結(jié)果。
　　 結(jié)果：
　　 1.成功擴增出傷寒沙門菌4201個蛋白編碼基因，芯片樣點位次驗證結(jié)果顯示點樣位點正確，雜交效果良好，表明傷寒沙門菌基因組DNA芯片制備成功；
　　 2.采用N9+GDP混合引物，直接摻入法標(biāo)記時，既能獲得較好標(biāo)記效果，又能節(jié)約試劑成本，同時減少繁瑣步驟所引

13、起的不必要失誤；
　　 3.PCR及序列分析證實，uhpA基因缺陷變異株中uhpA基因315bp被6bp取代，表明成功構(gòu)建uhpA基因缺陷變異株；
　　 4.基因表達譜比較分析結(jié)果表明，與野生株相比，傷寒沙門菌uhpA基因缺陷變異株在高滲應(yīng)激30分鐘，有21個基因顯示出明顯的表達差異，且全部明顯下調(diào)(2倍以上)。其中，參與調(diào)節(jié)半胱氨酸合成途徑無機硫酸鹽同化作用的相關(guān)基因全部下調(diào)，如cysJ，cysD，cysP，cysW，

14、cysU，cysA，cysC，cysK，cysH，cysN，cysI，cysM等；
　　 5.實時熒光定量RT-PCR驗證結(jié)果顯示，與基于DNA芯片的基因表達譜分析數(shù)據(jù)相比，兩者變化情況一致，相互吻合。
　　 結(jié)論：
　　 1.成功制備了傷寒沙門菌基因組DNA芯片，為有關(guān)傷寒沙門菌基因表達調(diào)控及致病性機理，進化和基因多樣性等方面的深入研究提供有效的技術(shù)支持；
　　 2.設(shè)計了基因表達譜用GDP引物，從而提

15、高了表達譜分析的靈敏度和特異性，成功構(gòu)建了基于傷寒沙門菌基因組DNA芯片的基因表達譜分析技術(shù)，為大規(guī)模的功能基因組研究提供了一個高效的技術(shù)平臺；
　　 3.成功構(gòu)建傷寒沙門菌uhpA基因缺陷變異株，可用于下游基因表達調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的分析；
　　 4.傷寒沙門菌UhpA參與高滲應(yīng)激后調(diào)節(jié)半胱氨酸合成途徑無機硫酸鹽的同化作用，拓寬了我們對于傷寒沙門菌基因表達調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的認(rèn)識；
　　 5.實時熒光定量PCR驗證了基因芯片實驗的