傷寒沙門菌Mig-14對基因表達(dá)的影響及相關(guān)功能研究.pdf

1、目的:
　　Mig-14作為細(xì)菌中一種重要的調(diào)節(jié)因子，在沙門菌入侵宿主和抵抗多粘菌素B的殺傷作用方面有重要作用，但其在傷寒沙門菌中的具體功能和機(jī)制還不清楚。本論文旨在研究Mig-14在傷寒沙門菌中的相關(guān)功能及其作用機(jī)制。
　　方法:
　　1.傷寒沙門菌的動(dòng)力實(shí)驗(yàn):從LB平板上用無菌牙簽挑取野生株與mig-14缺陷株單菌落接種在0.3％的半固體LB平板上，37℃培養(yǎng)8h后，測量動(dòng)力圈大小比較兩者的動(dòng)力。
　　2.傷

2、寒沙門菌對上皮細(xì)胞的侵襲力分析:將野生株與mig-14缺陷株培養(yǎng)至對數(shù)期(OD6000.4)，加入培養(yǎng)有HeLa細(xì)胞的24孔板中(MOI均為20)。培養(yǎng)90 min后將部分孔的細(xì)胞破膜，收集菌體后涂板過夜，菌落數(shù)代表細(xì)菌粘附細(xì)胞水平(T0);對另一部分細(xì)胞加入慶大霉素繼續(xù)培養(yǎng)90 min后，破膜涂板過夜，菌落數(shù)代表細(xì)菌侵襲水平(T90)，以T90/T0值代表細(xì)菌的侵襲力。
　　3.傷寒沙門菌在THP-1細(xì)胞內(nèi)生存力分析:將野生株與

3、mig-14缺陷株培養(yǎng)至對數(shù)期(OD6000.4)，加入到有THP-1細(xì)胞的24孔板中(MOI均為10)。培養(yǎng)1h后，加入慶大霉素作用1h，將其中一部分孔的細(xì)胞破膜，收集細(xì)菌涂板，計(jì)數(shù)菌落數(shù)(T0)代表基礎(chǔ)吞噬細(xì)菌水平;剩余孔內(nèi)的細(xì)胞培養(yǎng)12或24 h后，破膜收集細(xì)菌涂板，菌落數(shù)(T12或T24)作為細(xì)菌在胞內(nèi)的增殖水平，T12/T0和T24/T0代表細(xì)菌在THP-1細(xì)胞內(nèi)的生存能力。
　　4.多粘菌素B環(huán)境下細(xì)菌生長的觀察:以生

4、長時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD600值為縱坐標(biāo)繪制生長曲線，比較野生株與mig-14缺陷株兩者在多粘菌素B培養(yǎng)條件下的生長差異。
　　5.qRT-PCR分析細(xì)菌基因表達(dá)水平:將野生株與mig-14缺陷株在含多粘菌素B的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)5h，Trizol法提取總RNA，特異性逆轉(zhuǎn)錄后通過qRT-PCR分析兩種菌株間的基因表達(dá)差異。
　　6.Mig-14蛋白分段表達(dá):構(gòu)建pET22b(+)-mig-14-p重組質(zhì)粒，熱擊導(dǎo)入BL-21表達(dá)

5、菌中，培養(yǎng)至OD6000.6后加入IPTG誘導(dǎo)細(xì)菌表達(dá)重組蛋白Mig-14-p，利用KCl染色切膠法純化目的蛋白Mig-14-p，SDS-PAGE電泳鑒定目的蛋白純度。
　　7.Mig-14-p抗血清的制備:將重組蛋白Mig-14-p與等體積的弗氏完全佐劑研磨乳化后，于兔子背部皮下注射1mL，21天后，用Mig-14-p與弗氏不完全佐劑研磨形成的乳化抗原同樣免疫家兔，此后每隔10天加強(qiáng)免疫一次。ELISA檢測抗體效價(jià)達(dá)到104以上

6、時(shí)終止免疫，并用免疫印跡法測定抗血清的特異性。
　　8.免疫共沉淀實(shí)驗(yàn):收集傷寒沙門菌野生株在高滲(30 min)和多粘菌素B(30 min)條件下的細(xì)菌總蛋白，利用自制的抗Mig-14-p的抗血清進(jìn)行免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，探究是否存在與Mig-14相互作用的蛋白。
　　9.凝膠阻滯實(shí)驗(yàn):將由公司制備的Mig-14-c蛋白與ompF、 invF的啟動(dòng)子區(qū)域的DNA片段進(jìn)行孵育，用6％丙烯酰胺膠電泳來檢測二者的結(jié)合情況，探討Mig-

7、14是否能夠直接調(diào)控這兩個(gè)基因。
　　結(jié)果:
　　1.動(dòng)力實(shí)驗(yàn)表明，mig-14缺陷株比野生株細(xì)菌動(dòng)力增加。
　　2.與野生株相比，mig-14缺陷株對上皮細(xì)胞的侵襲力有所降低。
　　3.與野生株相比，mig-14缺陷株在THP-1細(xì)胞內(nèi)的生存能力下降。
　　4.生長曲線表明，在多粘菌素B培養(yǎng)條件下，傷寒沙門菌mig-14缺陷株與野生株相比，生長緩慢。
　　5.qRT-PCR結(jié)果顯示，在多粘菌素B培養(yǎng)

8、條件下，Mig-14可以上調(diào)iagA、invF基因的表達(dá)，下調(diào)figD、ompC、 ompF基因的表達(dá)。
　　6.成功制備了Mig-14-p和Mig-14-c重組蛋白。
　　7.成功制備了Mig-14-p抗血清，其效價(jià)為1∶64000。
　　8.免疫共沉淀結(jié)果提示未發(fā)現(xiàn)與Mig-14相結(jié)合的蛋白。
　　9.凝膠阻滯試驗(yàn)表明Mig-14-c可能不能與ompF、 invF啟動(dòng)子區(qū)域直接結(jié)合。
　　結(jié)論: