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文檔簡介
1、目的:通過構建LIM礦化蛋白.1(LMP—1)的真核表達質粒,并使其在分離培養(yǎng)的兔骨髓問充質干細胞(BMSCs)內表達,研究LMP一1對體外培養(yǎng)BMSCs成骨分化的影響。 方法:采用RT-PCR的方法分別從人的胎盤組織和含有人BMP-2的重組質粒中,克隆LMP一1和BMP-2,與真核表達質粒pIRES2-EGFP酶切連接,構建plRES2-EGFP-LMPl及pIRES2-EGFP-BMP2重組質粒。采用梯度離心方法從兔骨髓中分
2、離培養(yǎng)BMSCs。以第三代細胞為實驗對象,脂質體介導下分別將plRES2-EGFP-LMPl、pIRES2-EGFP-BMP2和pIRES2-EGFP質粒轉染細胞。熒光顯微鏡下觀察轉染效率,7天后收集細胞檢測其生物學性狀的變化。RT-PCR比較LMP—l、BMP-2及I型膠原的表達,堿性磷酸酶活性檢測ALP活性,免疫組化染色比較骨鈣素表達。 結果:經酶切和測序鑒定plRES2-EGFP-LMPl和plRES2-EGFP-BMP2
3、重組質粒構建成功。成熟的體外分離培養(yǎng)BMSCs方法方便簡單,收獲細胞數(shù)量多且增殖能力強。脂質體介導重組質粒轉染BMSCs后,通過熒光顯微鏡觀察轉染成功且轉染效率15%左右。收集細胞RT-PCR證實表達目的基因,LMP一1和BMP-2轉染組可以明顯促進細胞分泌ALP的活性,誘導I型膠原和骨鈣素的表達。 結論:成功構建plRES2-EGFP-LMPl和pIRES2-EGFP-BMP2重組質粒。分別轉染BMSCs后表達目的基因,比較轉
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