細胞周期蛋白Cyclin D1與PACSIN2在影響細胞遷移中的作用及其機制的研究.pdf

1、腫瘤是一種細胞周期性疾病，腫瘤的發(fā)生與細胞增殖失控、分化障礙及凋亡受阻密切相關，因此與細胞增殖有關的周期蛋白成為研究癌癥發(fā)生的熱點之一。細胞周期的變化是一個復雜的過程，許多蛋白參與調(diào)控該過程。其中D型周期蛋白作用于G1期，分為3個亞型：Cyclin D1、Cyclin D2、Cyclin D3。但只有Cyclin D1被檢測到在腫瘤中過度表達。Cyclin D1又存在Cyclin D1a和CyclinD1b兩種亞型，通常Cyclin D

2、1即指Cyclin D1a。
　　 正常的細胞周期有序的循環(huán)是通過激活和失活細胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)來實現(xiàn)的。CyclinD1作為細胞周期進程的啟動子，可以與CDK4結合形成復合體，通過磷酸化和失活視網(wǎng)膜母細胞瘤蛋白pRb，促進細胞周期從G1期到S期的進展，并通過這種方式介導DNA的合成、促進細胞的生長增殖。而Cyclin D1在不依賴CDK的情況下同樣可以對細胞生長、分化和新陳代謝發(fā)揮作用。
　　 研究表明，C

3、yclin D1在人類多種腫瘤如乳腺癌、結腸癌、前列腺癌以及造血系統(tǒng)惡性腫瘤中存在過度表達。在侵襲性乳腺腫瘤中，50％病例存在Cyclin D1蛋白的過度表達。為了探討Cyclin D1在腫瘤中的作用，我們做了大量研究。我們發(fā)現(xiàn)Cyclin D1缺失的小鼠會耐受致癌基因誘導的腫瘤發(fā)生；Cyclin D1基因的缺失也可以降低細胞存活和DNA合成，增加線粒體的大小和活性，抑制血管、骨髓巨噬細胞、成纖維細胞和乳腺上皮細胞的遷移能力。臨床病例也

4、顯示CyclinD1過度表達與腫瘤轉(zhuǎn)移存在聯(lián)系。因此，疾病的惡性進展和轉(zhuǎn)移可能與CyclinD1密切相關。
　　 細胞的遷移在細胞形態(tài)發(fā)生、組織修復和腫瘤轉(zhuǎn)移中是必不可少的。腫瘤轉(zhuǎn)移是從腫瘤原發(fā)病灶的腫瘤細胞的遷移開始的，經(jīng)過進入血管的內(nèi)滲和穿過血管壁的溢出過程，最后到達遠處器官或組織從而產(chǎn)生新的腫瘤。抑制腫瘤轉(zhuǎn)移是我們治療腫瘤的重要途徑。因此，了解細胞遷移或侵襲機制會幫助我們更好的理解腫瘤細胞的散布機制并為腫瘤治療帶來新的契機

5、。探討Cyclin D1在遷移或侵襲中的作用可以給我們的研究指明新的方向。
　　 大量研究發(fā)現(xiàn)Cyclin D1在調(diào)節(jié)雌激素受體α(ERα)、雄激素受體(AR)等的轉(zhuǎn)錄活性時，必須要結合輔助激活因子或轉(zhuǎn)錄因子。因此我們推測Cyclin D1在細胞生長、遷移及腫瘤中的作用是通過結合特殊的蛋白質(zhì)形成復合物而產(chǎn)生的。為了研究Cyclin D1結合蛋白在調(diào)節(jié)Cyclin D1功能中的作用，我們純化Cyclin D1結合蛋白復合物并發(fā)現(xiàn)了

6、神經(jīng)元蛋白激酶C酪蛋白激酶底物2(Proteinkinase C and casein kinase substrate in neurons protein2，PACSIN2)。PACSIN2是來源于雞心臟的52KDa粘合蛋白(FAP52)的同源體，它的家族成員在功能上被看作是細胞黏著斑中的胞漿輔助蛋白，參與囊泡的形成與運輸。本課題就Cyclin D1與PACSIN2在影響細胞遷移中的作用進行研究。
　　 一、發(fā)現(xiàn)并鑒定PAC

7、SIN是一種cyclin D1結合蛋白，并探討其結合機制
　　 目的：
　　 發(fā)現(xiàn)并鑒定出PACSIN2是一種Cyclin D1結合蛋白，探討PACSIN2是否可以特異性的結合Cyclin D1而非其他家族成員及其結合機制。
　　 方法：
　　 1.通過免疫沉淀方法純化Cyclin D1結合蛋白，并經(jīng)過銀染電泳凝膠、凝膠片切除及消化過程，最后進行質(zhì)譜測定分析和序列分析。
　　 2.將帶有Flag抗

8、原標記的不同Cyclin D1質(zhì)粒DNA，包括野生型和突變型DNA，分別和帶有Myc抗原標記的PACSIN2質(zhì)粒DNA，使用磷酸鈣轉(zhuǎn)染的方法共轉(zhuǎn)于293T細胞。通過免疫沉淀-免疫印跡的方法分析該細胞。
　　 3.將帶有Flag抗原標記的不同Cyclin D質(zhì)粒DNA，包括Cyclin D1，D2和D3及其突變型DNA，分別和帶有Myc抗原標記的PACSIN2質(zhì)粒DNA，使用磷酸鈣轉(zhuǎn)染的方法共轉(zhuǎn)于293T細胞。通過免疫沉淀-免疫印

9、跡的方法分析該細胞。
　　 4.將帶有Myc抗原標記的不同PACSIN質(zhì)粒DNA，包括PACSIN1，PACSIN2和PACSIN3 DNA分別和帶有Flag抗原標記的Cyclin D1質(zhì)粒DNA，使用磷酸鈣轉(zhuǎn)染的方法共轉(zhuǎn)于293T細胞。通過免疫沉淀-免疫印跡的方法分析該細胞。
　　 5.將帶有Myc抗原標記的不同PACSIN2質(zhì)粒DNA，包括野生型和變異型DNA，分別和帶有Flag抗原標記的Cyclin D1質(zhì)粒DNA

10、，使用磷酸鈣轉(zhuǎn)染的方法共轉(zhuǎn)于293T細胞。通過免疫沉淀.免疫印跡的方法分析該細胞。
　　 結果：
　　 1.通過純化Cyclin D1結合蛋白，得出CDK4(細胞周期蛋白依賴性激酶)，70kD熱休克同源蛋白(Hsc70)和一種額外的蛋白質(zhì)。經(jīng)過質(zhì)譜測定分析和序列分析，鑒定出這種蛋白是PACSIN2。這種蛋白被看做是來源于雞心臟的52KDa粘合蛋白(FAP52)的同源體。
　　 2.敲除細胞周期蛋白的酸性氨基酸序列

11、后，Cyclin D1無法與PACSIN2結合。只有Cyclin D1和Cyclin D2可以與PACSIN2結合，但Cyclin D3、Cyclin D1b不能與其結合。
　　 3.免疫沉淀-免疫印跡實驗發(fā)現(xiàn)PACSIN家族中只有PACSIN2可以和CyclinD1特異性的結合，PACSIN1和PACSIN3不能和Cyclin D1結合。
　　 4.通過敲除PACSIN2蛋白序列上NPF結構域可以使得PACSIN2失去

12、與Cyclin D1結合的能力。
　　 結論：
　　 1.發(fā)現(xiàn)并鑒定出PACSIN2是可以與Cyclin D1特異性結合的Cyclin D1結合蛋白。
　　 2.Cyclin D1通過其羥基末端的E-rich基序與PACSIN2結合。
　　 3.PACSIN2通過其NPF結構域與Cyclin D1結合。
　　 二.PACSIN2抑制正常細胞和腫瘤細胞的遷移能力。是通過與CyclinD1a結合而非C

13、yclin D1b實現(xiàn)的；
　　 目的：
　　 觀察Cyclin D1和PACSIN2在細胞中的蛋白結合共存位置，并確定作為CyclinD1結合蛋白的PACSIN2的生物學功能，以及其功能的發(fā)揮是否依賴于Cyclin D1。
　　 方法：
　　 1.在MRC5細胞(人胚胎肺成纖維細胞)中通過免疫組織化學染色方法觀察Cyclin D1和PACSIN2蛋白結合共存位置
　　 2.通過Transwell

14、 migration assay分析PACSIN2基因敲除型和野生型小鼠皮膚成纖維細胞遷移能力的區(qū)別。
　　 3.通過特異性siRNA降低LNCaP細胞(人前列腺癌細胞)中PACSIN2蛋白表達水平后，Transwell migration assay分析其遷移能力的變化。
　　 4.通過特異性siRNA降低3T3細胞(小鼠胚胎成纖維細胞)中PACSIN2蛋白表達水平后，Cell spreading assay觀察細胞伸

15、展能力的變化。
　　 5.分別在Cyclin D1敲除的小鼠上皮成纖維細胞Cyclin D1-/-細胞，以及該細胞經(jīng)過Cyclin D1a、Cyclin D1b質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)導后的兩種細胞Cyclin D1-/-+D1a細胞和Cyclin D1-/-+D1b細胞中，使用特異性siRNA降低PACSIN2蛋白表達水平后，通過Transwell migration assay觀察細胞遷移能力的變化，Cell spreading ass

16、ay分析其伸展能力的變化。
　　 結果：
　　 1.MRC5細胞中，Cyclin D1和PACSIN2結合共存于細胞膜皺褶中。
　　 2.PACSIN2基因敲除后，小鼠皮膚成纖維細胞的遷移能力增強；PACSIN2siRNA可以增強人前列腺癌細胞LNCaP的遷移能力，降低小鼠胚胎成纖維細胞3T3細胞的伸展能力。
　　 3.PACSIN2 siRNA可以增強Cyclin D1-、-+D1a細胞的遷移能力，降低

17、細胞的伸展能力；但是在Cyclin D1-/-細胞和Cyclin D1-/-+D1b兩組細胞中沒有變化。
　　 結論：
　　 1.內(nèi)源性PACSIN2可以抑制人前列腺癌細胞和小鼠成纖維細胞的遷移能力，增強小鼠成纖維細胞的伸展能力。
　　 2.在Cyclin D1a存在的前提下，PACSIN2才能發(fā)揮其抑制細胞遷移、增強細胞伸展的能力。
　　 總之，作為Cyclin D1的結合蛋白，PACSIN2通過其結構