低氧誘導(dǎo)因子-1負(fù)調(diào)控Cyclin D1的分子機(jī)制及其在腫瘤化療抵抗中的作用研究.pdf

1、第一部分 HIF-1負(fù)調(diào)控cyclinD1的分子機(jī)制及其在肺癌化療抵抗中的作用研究 研究背景和目的: 哺乳動(dòng)物細(xì)胞可以通過改變代謝狀態(tài)和生長速度來適應(yīng)環(huán)境中氧濃度的變化，其中最常見反應(yīng)就是生長抑制。低氧可以引起多種細(xì)胞的周期阻滯，但具體機(jī)制仍未闡明，近年來研究發(fā)現(xiàn)低氧誘導(dǎo)因子(Hypoxia-InducibleFactor-1，HIF-1)是介導(dǎo)這一過程的重要分子。HIF-1以異源二聚體的形式存在，由α亞單位(H

2、IF-1α)和β亞單位(HIF-1β)組成。常氧條件下，HIF-1α極易被降解，其降解途徑是泛素-蛋白水解酶復(fù)合體；低氧條件下，HIF-1α降解過程被阻斷，導(dǎo)致HIF-1α積累，并與HIF-1β結(jié)合形成活性形式，影響多種靶基因表達(dá)，參與調(diào)節(jié)血管形成、鐵代謝、葡萄糖代謝、細(xì)胞增殖和存活等生理過程。HIF-1靶基因結(jié)構(gòu)上都包含有低氧反應(yīng)元件(HypoxiaResponseElement，HRE)，HRE是指被調(diào)控基因的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子中包含一

3、段特定的核苷酸序列，其核心序列為5’-RCGTG-3’?；罨腍IF-1與其結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合后，在靶基因的轉(zhuǎn)錄起始部位形成一個(gè)轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物，從而調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄。 細(xì)胞周期是一種非常復(fù)雜的過程并受到精細(xì)的調(diào)節(jié)，有大量調(diào)節(jié)蛋白參與其中。此過程的核心是細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶(CyclinDependentKinases，CDKs)，CDK的激活又依賴于另一類呈細(xì)胞周期特異性或時(shí)相性表達(dá)的細(xì)胞周期蛋白(cyclins)，其中cyclin

4、D1就是一種非常重要的周期蛋白。CyclinD1基因?qū)儆诩?xì)胞周期素家族中的一員，基因定位于染色體11q13，編碼由295個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)。CyclinD1可與細(xì)胞周期索依賴激酶CDK4組成CyclinD1/CDK4復(fù)合物，使Rb磷酸化，從而釋放出轉(zhuǎn)錄因子E2F，促進(jìn)細(xì)胞周期由G1期到S期的轉(zhuǎn)變。機(jī)體中的細(xì)胞時(shí)常受到低氧的刺激，而在腫瘤細(xì)胞特別是實(shí)體瘤中，缺氧更是普遍存在的現(xiàn)象。低氧條件下，細(xì)胞中產(chǎn)生的HIF-1調(diào)節(jié)靶基因轉(zhuǎn)錄，引起一

5、系列細(xì)胞對缺氧的反應(yīng)，具有重要的病理生理學(xué)意義。腫瘤組織的缺氧被認(rèn)為與腫瘤對放療、化療耐受及惡性進(jìn)展、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。近年來發(fā)現(xiàn)HIF-1是腫瘤治療中重要的靶點(diǎn)分子，可能參與了實(shí)體腫瘤對化療藥物的耐藥機(jī)制。我們預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果發(fā)現(xiàn)HIF-1對cyclinD1存在負(fù)調(diào)控作用，而且通過序列分析，在cyclinD1的啟動(dòng)區(qū)中發(fā)現(xiàn)了HIF-1結(jié)合位點(diǎn)，本研究旨在闡明HIF-1對cyclinD1的調(diào)控機(jī)制，觀察這種調(diào)控作用對腫瘤細(xì)胞生長和化療敏感性

6、的影響，加深我們對腫瘤生物學(xué)的認(rèn)識，為研發(fā)新的腫瘤治療藥物和方法提供理論依據(jù)。 實(shí)驗(yàn)方法： 一、利用外源刺激物或低氧處理，觀察HIF-1對cyclinD1的負(fù)調(diào)控作用 1．外源刺激物誘導(dǎo)或低氧處理使HIF-1活化后，利用報(bào)告基因、RT-PCR和western-blot檢測正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中cyclinD1表達(dá)的變化； 2．應(yīng)用HIF-1基因敲除細(xì)胞驗(yàn)證在正常細(xì)胞中HIF-1對cyclinD1的調(diào)控作用；

7、 3．探明在生理?xiàng)l件下，腫瘤細(xì)胞中過度表達(dá)HIF-1對cyclinD1的影響； 4．利用HIF-1的顯性負(fù)性突變體(DN-HIF)抑制HIF-1活化，對上述的結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。 二、HIF-1對腫瘤生長的影響 1．建立穩(wěn)定表達(dá)DN-HIF的A549和Beas-2B細(xì)胞系； 2．利用流式細(xì)胞分析和CCK-8生長曲線測定方法，觀察抑制HIF-1活性對腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期和增殖的影響； 3．將上述腫瘤

8、細(xì)胞接種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物后，觀察腫瘤的生長情況； 4．利用免疫組化方法驗(yàn)證荷瘤鼠腫瘤中HIF-1與cyclinD1表達(dá)的關(guān)系。 三、HIF-1對cyclinD1調(diào)控作用的分子機(jī)制 1．構(gòu)建啟動(dòng)區(qū)中HRE突變的cyclinD1報(bào)告基因質(zhì)粒，分析HIF-1對cyclinD1的調(diào)控是否為直接作用； 2．進(jìn)行ChIP實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步明確HIF-1與cyclinD1promoter間的直接相互作用； 3．構(gòu)建HDAC的

9、RNA干擾質(zhì)粒，并利用HDAC抑制劑TSA，分析HDAC在HIF-1負(fù)調(diào)控cyclinD1機(jī)制中的作用。 四、HIF-1在肺癌細(xì)胞化療敏感性中的作用 1．利用TUNNEL方法和流式細(xì)胞儀檢測，觀察HIF-1在周期特異性化療藥物5-FU誘導(dǎo)的肺癌細(xì)胞凋亡中的作用； 2．研究HIF-1對cyclinD1的調(diào)控作用對腫瘤細(xì)胞化療敏感性的影響。 結(jié)論： 1．在正常肺上皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中，常氧條件和低氧條件

10、下，低氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxiainduciblefactor-1，HIF-1)均能夠負(fù)調(diào)控周期素D1(cyclinD1)； 2．HIF-1可以直接與cyclinD1啟動(dòng)區(qū)中的HRE相互作用，起到負(fù)調(diào)控的作用，該調(diào)控作用需要組蛋白去乙?；?7(HDAC7)的參與，TSA處理和干擾HDAC7均能抑制這種負(fù)調(diào)控； 3．HIF-1負(fù)調(diào)控cyclinD1能夠引起肺癌細(xì)胞A549周期阻滯，抑制細(xì)胞的增殖，在荷瘤小鼠體內(nèi)也能觀

11、察到HIF-1與cyclinD1的負(fù)相關(guān)，這可能是腫瘤細(xì)胞逃避放、化療的機(jī)制之一； 4．A549細(xì)胞中外源表達(dá)DN-HIF能夠顯著增加細(xì)胞周期特異性化療藥物5-FIJ引起的細(xì)胞凋亡，而干擾cyclinD1后5-FU引起的細(xì)胞凋亡被明顯抑制。這為我們理解腫瘤化療抵抗的機(jī)制和開發(fā)新的治療藥物提供了新的思路。 第二部分 CyclinG1誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化促進(jìn)肝癌轉(zhuǎn)移 肝癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移是一個(gè)十分復(fù)雜的問題，國內(nèi)外研究發(fā)

12、現(xiàn)不少的癌基因、生長因子等與肝癌侵襲性相關(guān)，多種細(xì)胞外基質(zhì)成分也有重要作用，而且可能與原發(fā)瘤的基因特性有關(guān)。但是肝癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的機(jī)制仍然沒有完全闡明，下一步的重點(diǎn)將是如何早期預(yù)測肝癌的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，并盡早施行針對性的抗轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)治療。 由于傳統(tǒng)的臨床預(yù)后指標(biāo)有其自身的局限性，尚不能完全反映肝癌的生物學(xué)特性。為了進(jìn)一步指導(dǎo)肝癌的診斷、治療和預(yù)后的判斷，尋找其它有效的分子生物學(xué)指標(biāo)一直以來都是肝癌研究的熱點(diǎn)。 細(xì)胞周期蛋白G是cyc

13、lins家族成員之一，目前發(fā)現(xiàn)cyclinG主要有2種亞型cyclinG1和cyclinG2℃yclinG1與其他的周期蛋白不同，其N端有一典型的細(xì)胞周期蛋白盒，但沒有降解盒或PEST序列，也沒有找到相應(yīng)的細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶，其生物學(xué)功能尚未完全闡明，有證據(jù)表明cyclinG1可能參與DNA損傷修復(fù)、細(xì)胞周期調(diào)控、凋亡等細(xì)胞生物學(xué)過程，近來研究發(fā)現(xiàn)cyclinG1與腫瘤的關(guān)系密切，在多種腫瘤中都存在著異常表達(dá)，可能對腫瘤的發(fā)生發(fā)展起

14、到了促進(jìn)作用。 實(shí)驗(yàn)方法： 1．利用RT-PCR、western-blot和免疫組織化學(xué)方法檢測肝癌細(xì)胞系或者肝癌臨床組織樣品中cyclinG1的表達(dá)情況； 2．利用慢病毒系統(tǒng)建立cyclinG1穩(wěn)定高表達(dá)的細(xì)胞株L02/cyclinG1、SMMC-7721/cyclinG1和HepG2/cyclinG1及其相應(yīng)的對照細(xì)胞株； 3．侵襲浸潤實(shí)驗(yàn)：比較SMMC-7721/cyclinG1和：HepG2/cy

15、clinG1與其對照組SMMC-7721/GFP和HepG2/GFP在侵襲浸潤特性上的差異； 4．劃痕損傷實(shí)驗(yàn)：比較SMMC-7721/cyclinG1和HepG2/cyclinG1與其對照組SMMC-7721/GFP和．HepG2/GFP在遷移動(dòng)力學(xué)功能上的差異： 5．生長曲線：比較L02/cyclinG1、SMMC-7721/cyclinG1和HepG2/cyclinG1及其對照細(xì)胞系在分裂增殖上的差異： 6

16、．動(dòng)物試驗(yàn)：比較SMMC-7721/cyclinG1細(xì)胞系與其對照細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)成瘤和轉(zhuǎn)移特性的差異； 7．形態(tài)學(xué)觀察，免疫組織化學(xué)等方法評價(jià)cyclinG1對肝癌細(xì)胞株上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的影響，并檢測EMT相關(guān)特征分子和干細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)變化。 利用流式細(xì)胞和經(jīng)典信號通路的研究方法，初步探討cyclinG1影響肝癌轉(zhuǎn)移特性的分子機(jī)制。 結(jié)論： 1．CyclinG1在肝癌細(xì)胞系和臨床組織樣品中普遍呈現(xiàn)

17、中高表達(dá)，提示其與肝癌發(fā)生發(fā)展有密切的相關(guān)性； 2．CyclinG1在肝癌中不僅與肝癌發(fā)生相關(guān)，還可能作為一種腫瘤進(jìn)展基因起作用，可以影響肝癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移特性，從而提高肝癌的惡性程度； 3．CyclinG1可能通過作用于PI3K/AKT信號通路對EMT的相關(guān)分子進(jìn)行調(diào)控，促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，甚至獲得干細(xì)胞潛能，最終影響肝癌細(xì)胞的浸潤轉(zhuǎn)移能力； 4．CyclinG1有可能成為判斷肝癌患者進(jìn)展及預(yù)后的一個(gè)新分子標(biāo)志物