綠茶提取物EGCG對HPV-16癌蛋白誘導的肺癌血管生成的影響及其機制.pdf

1、[目的]
　　近年的研究已發(fā)現，人乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)感染可能與肺癌有關，而且我們的前期研究結果還證實，HPV-16癌蛋白可通過誘導缺氧誘導因子1α(hypoxia-inducible factor1α，HIF-1α)過表達，促進肺癌體內外血管生成。血管生成是實體瘤生長和轉移的關鍵。肺癌作為實體瘤的一種，因肺部的特殊結構和功能，其血管生成更具典型性。因此，抑制肺癌血管生成在HPV相關肺癌的

2、防治中具有重要意義。已有研究報道，綠茶提取物表沒食子兒茶素沒食子酸酯[(-)-epigallocatechin-3-gallate，EGCG]能抑制腫瘤血管生成，但EGCG對HPV相關肺癌血管生成的影響及其機制仍不清楚。所以，本研究的目的是:通過分別建立HPV-16 E6和E7癌蛋白誘導的HIF-1α過表達肺癌細胞模型和肺癌體內外血管生成模型，探討EGCG對HPV-16 E6和E7癌蛋白誘導的肺癌血管生成的影響及其潛在的分子機制，特別是

3、HIF-1α的中心調控作用。
　　[方法]
　　分別用EGCG（10μmol/L、25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L）處理已轉染含有HPV-16 E6或E7癌基因的EGFP質粒的肺癌細胞(A549和NCI-H460)。16h后用免疫印跡(Western blotting)檢測HIF-1α、p-ERK和p-Akt的蛋白表達變化，實時定量PCR檢測HIF-1α的mRNA表達變化。收集EGCG處理組和未用藥處理

4、組的條件培養(yǎng)液，用酶聯免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測上清液中血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和白介素-8（interleukin-8，IL-8）的蛋白濃度。
　　HIF-1α依賴性的分析:將非特異性HIF-1αsh-RNA(HIF-1αnon-specific sh-RNA，HIF-1αNS-sh-

5、RNA)和特異性HIF-1αsh-RNA分別與pEGFP-HPV-16E6、E7共轉染肺癌細胞（A549和NCI-H460），再用Western blotting檢測HIF-1α、p-Akt、p-ERK的蛋白表達，并對肺癌體內外血管生成進行分析。
　　體外血管生成分析:用ECM625 Matrigel作為基質檢測EGCG對HPV-16 E6、E7癌蛋白誘導的人臍靜脈內皮細胞(human umbilical veinendothel

6、ial cells，HUVECs)微管形成的影響。同時將非特異性HIF-1αsh-RNA和特異性HIF-1αsh-RNA分別與pEGFP-HPV-16 E6或E7共轉染肺癌細胞（A549和NCI-H460），檢測HPV-16 E6、E7癌蛋白誘導的HUVECs微管形成是否具HIF-1α依賴性。
　　體內血管生成分析:分別收集各種處理的肺癌細胞A549和其條件培養(yǎng)液，與BD Matrigel Matrix混合后注射入裸鼠腋側皮下，分

7、析EGCG對HPV-16 E6和E7癌蛋白誘導的肺癌體內血管生成的影響以及HPV-16 E6和E7癌蛋白誘導的肺癌體內血管生成是否具HIF-1α依賴性。
　　[結果]
　　1.Western blotting結果顯示:EGCG抑制了HPV-16 E6和E7癌蛋白誘導的HIF-1α過表達，且抑制作用隨EGCG濃度升高而增強。HPV-16 E6和E7癌蛋白使肺癌細胞（A549和NCI-H460）中Akt和ERK的磷酸化水平增強;

8、用EGCG處理后，隨著EGCG濃度增加，p-Akt的蛋白表達水平逐漸降低，但p-ERK的蛋白表達水平無明顯變化。與非特異性HIF-1αsh-RNA相比，特異性HIF-1α sh-RNA與pEGFP-HPV-16 E6、E7共轉染肺癌細胞(A549和NCI-H460)后，抑制了HPV-16 E6和E7癌蛋白誘導的HIF-1α蛋白表達，同時也降低了HPV-16 E6、E7癌蛋白誘導的p-Akt蛋白表達水平，但對p-ERK蛋白表達無明顯影響。

9、說明，HPV-16癌蛋白可抑制Akt的激活，但對ERK的激活沒有明顯作用。
　　2.實時定量PCR結果顯示:HPV-16 E6和E7癌蛋白對肺癌細胞(A549和NCI-H460) HIF-1α mRNA水平無明顯影響，且EGCG對HIF-1αmRNA表達亦無明顯作用。
　　3.ELISA結果顯示:EGCG抑制了HPV-16 E7癌蛋白誘導的VEGF及IL-8的蛋白分泌，并具有劑量依賴性。50μmol/L、100μmol/L

10、EGCG處理組與對照組相比，VEGF及IL-8的蛋白分泌差異具有顯著性(P＜0.01)。
　　4.體外血管生成實驗結果顯示:相對于對照組(Control)、空載體組(EmptyVector)，pEGFP-HPV-16 E6和E7轉染組細胞的條件培養(yǎng)液明顯刺激了HUVECs的微管形成。當用100μmol/L EGCG處理或共轉染特異性HIF-1αsh-RNA后，HPV-16 E6和E7癌蛋白刺激的HUVECs微管形成受到抑制，總管長

11、度明顯縮短(P＜0.05)。
　　5.體內血管生成實驗結果顯示:pEGFP-HPV-16 E6和E7轉染組血管形成比對照組、空載體組更明顯，并且pEGFP-HPV-16 E6和E7轉染組血紅蛋白含量及HIF-1α和VEGF蛋白表達較對照組、空載體組明顯升高(血紅蛋白測定P＜0.05)。當用EGCG處理pEGFP-HPV-16 E6和E7轉染組及特異性HIF-1αsh-RNA與pEGFP-HPV-16 E6、E7共轉染后血管生成明顯